创伤弧菌溶细胞素融合蛋白诱导inos表达与初步机制的的研究

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1、万方数据温州医学院硕士论文创伤弧菌溶细胞素融合蛋白诱导iNOS表达及初步机制研究中文摘要目的：1、研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhAl)对小鼠巨噬细胞的体外毒性作用和吞噬功能的影响。2、研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮(NO)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的情况：观察p38MAPK信号途径对rVvhA和IFN-T协同诱导J774A．1细胞NO合成的调节作用。3、为探索创伤弧菌溶细胞素(vibrovulnificuscytolysin，WC)的细胞毒性分子机制提供一些实验依据。方法：l、诱导含pET-28a(

2、+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白，应用Ni2+亲和层析方法对rVvhA进行纯化；利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性。2、将复性纯化蛋白作用于小鼠巨噬细胞(J774A．1、PM西)，应用MTT法、吞噬中性红实验、Griess法和荧光法分别检测rVvhA对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用以及刺激细胞一氧化氮合成、一氧化氮合酶活性的影响；应用RT．PCR和免疫荧光法检测rVvhA对小鼠J774A．1细胞iNOSmRNA和蛋白水平表达的影响。分析p38MAPK抑制剂对rVvhA诱导J774A．1细胞NO合成的调节，初步评价p38MA

3、PK在rVvhA诱导巨噬细胞NO合成的信号通路中发挥的作用。结果：1、含pET．28a(+)whA重组质粒的BL21大肠杆菌经o．5mmol／LIPTG诱导后表达的融合蛋白Mr约为54kDa,电泳结果与该融合蛋白的理论推算值基本相符。表达蛋白质经三步洗涤后，再经Ni2+．NTA柱纯化，其纯度达88．o％左右。纯化的rVvhA经复性液复性后，具有溶血活性。2、MTT和中性红吞噬实验结果显示rVvhA具有降低小鼠巨噬细胞的存活率活性和吞噬功能，呈剂量依赖性；以脂多糖与IFN一／协同作用作为阳性对照组，Griess法和荧光法实验结果显示在巧N吖或rVvh单独作用时，诱

4、导巨噬细胞合成低量的NO以及细胞内NOS活性较低，但在IFN-?存在时，浓度为1．6HU／ml和1．2HU／mlrVvhA分别诱导J774A．1和PM①细胞24h后，培养上清液N0浓度达峰值，且此浓度时增加细胞内NOS活性；RT-PCRfFIJ免疫荧光法实验结果显示IFN-T存在时，rVvhA增力fl万方数据温州医学院硕士论文J774A．1细胞iNOSmRNA和蛋白水平表达。]ip38MAPK抑制可一定程度降低J774A．1细胞培养上清液中NO的含量以及细胞内NOS活性。结论：本实验证实，rVvhA具有通过干扰素叫对信号依赖途径诱导巨噬细胞NO合成的生物学活性。

5、提示rVvhA诱导巨噬细胞NO合成增加，这一机制可能参与rVvhA的细胞毒性作用，NO可能作为一种生物信使分子和细胞毒效应因子，形成瀑布效应，加重病程进展。p38MAPK抑制剂可一定程度降低J774A．1细胞中NO合成和NOS活性，推测p38MAPK信号途径可能参与rVvhA诱导巨噬细胞合成NO，但与rVvhA作用浓度和细胞类型有关。进一步证实rVvhA替代天然的创伤弧菌溶细胞素(WC)用于创伤弧菌溶细胞素致病机制研究的具有一定的可行性，为进一步研究创伤弧菌溶细胞毒素细胞毒性机制中的有关信号分子以及传导途径提供了一些相关的实验与理论依据。关键词：创伤弧菌；溶细胞

6、素；rVvhA；J774A．1；PM西；干扰素吖；一氧化氮；诱导型一氧化氮合酶；p38MAPK万方数据温州医学院硕士论文StudyonInductionMechanismsofiNOSExpressionby阳，J5I。4RecombinantProteinABSTRACTObjective1．ToinvestigateeffectsofvvhArecombinantprotein(rWhA)ontoxicityandphagocyticactivityofmouseJ774A．1andPM@cellsinvitro．2，Toanalyzethesynthesi

7、sofnitricoxide(NO)andtheexpressionofofinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)inmouseJ774A．1andPMmcellsinducedbywhArecombinantprotein(rVvhA)：cytolysinofV．vulnificus，Toexplorerolesofp38mitogenactivatedproteinkinase(p38MAPK)insynthesisofNOinJ774A．1cellsinducedbyrVvhAandIFN-，r．3．Toprovideexpe

8、rimenteviden