重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备论文

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1、重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备论文张琦，卢改娜，谢旦立，甄伟春，楼永良【摘要】目的?：制备重组创伤弧菌溶细胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)鼠源性单克隆抗体，并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定，为创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin.freelonoclonalantibodyagainstrebinantVibriovulnificuscytolysin(rVVC)munoglobulinentofrapiddetectionkitofVibriovulnificuscy

2、tolysin.Methods:?IPTGmuneBALB/c.TheeffectsofexpressionandpurificationofrVVCinedbySDS-PAGE.Thehybridomacelllinestosecreteanti-rVVCmonoclonalantibodiesatechniqueandELISA，andtheniteddilution.Doubleimmunodiffusionassayonoclonalantibody.ELISAanddoubleimmunodiffusionassayinethespecificity.

3、Results:?ThemiceimmunizedbyrVVCdilutionto1:12?800byELISA.Taonoclonalantibodies.Themonoclonalantibodiesshootherbacteria.Conclusion:?BALB/cmiceissuccessfullyimmunizedandtouse-originhybridomacelllinesnamedB2C7andE3F4onoclonalantibodiesagainstrVVCareacquired.Thetypeofmonoclonalantibodyag

4、ainstrVVCisIgG1.Keya;monoclonalantibody创伤弧菌(Vibriovulnificus，Vv)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，主要存在于海水及海产品中，可引起原发性败血症和严重的创口感染1-2。近几年，浙江沿海、深圳也时有报道该菌感染病例，已引起很多专家学者关注。创伤弧菌可能包含诸多毒力因子3，溶细胞素是其唯一分泌至胞外具有种特异性的膜成孔类外毒素4，可作用于多种靶细胞诱导细胞凋亡、坏死，引起细胞炎症反应等5-6。此外，体外重组的创伤弧菌溶细胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)亦具

5、有典型的细胞毒活性，能引起人ECV304细胞凋亡7，诱导人SMMC7721细胞产生细胞应激，上调其TNF-α和HSP90的表达8。目前，有关创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)抗体的研究较少，姚蔚等9曾利用体外rVVC制备了其多克隆抗体，并证实该多抗能阻断rVVC对SMMC7721的细胞毒作用，为保护性抗体。而单克隆抗体相比多克隆抗体，具有更高的特异性。因此，本研究中，我们采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化原核表达的rVVC，采用杂交瘤技术制备鼠源性rVVC单克隆抗体并进行免疫学鉴定，以期为VVC致病机制的深入研究及创伤

6、弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素的快速检测试剂盒研发奠定基础。1??材料和方法1.1??材料1.1.1??细胞系、菌种及质粒：小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。E.coliBL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本实验室构建完成及保存。1.1.2??实验动物：清洁级雌性6周龄BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心(上海斯莱克实验动物有限公司)，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。1.1.3??主要试剂：Ni2+-NTA亲和层析树脂购自上海申能博彩生物科技有限公司。异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自宝生物

7、工程(大连)有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、盐酸胍及精氨酸购自BBI公司。HRP标记羊抗小鼠IgG、TMB底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司。优级胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI1640购自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培养基购自SIGMA公司。PEG2000购自上海生工。1.2??方法1.2.1??rVVC的表达、纯化及复性：将pET28a(+)-vvhA-E.coli接种于含有卡那霉素(终浓度为25～30μg/mL)的固体培养基中37℃孵育，挑取生长菌落至含有卡那霉素(同上)的LB液体

8、培养基37℃摇床培养。测