创伤弧菌溶细胞素基因vvha的表达和其融合蛋白对细胞的毒性作用

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1、浙江大学硕士学位论文创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的表达和其融合蛋白对细胞的毒性作用浙江大学医学院硕士研究生导师病原生物学赵旭鸿陆淼泉教授严杰教授中文摘要背景和目的创伤弧菌(ⅥbIiovullli矗clls)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，存在于海水及海产品中，由F蚰er等于1979年首先报道。该菌具有强烈毒性，主要引起原发性败血症和严重的创口感染。败血症多与生食含菌的牡蛎等贝类海产品有关，尤其好发于肝硬化、血色素沉着症、地中海贫血等体内荷铁量过多的人群中，病死率超过50％。皮肤创口受海水中的创伤弧菌感染，常于24小时内迅速导致严重的组织坏死。创伤弧菌

2、的确切致病机理至今尚未完全明了。溶细胞素是由结构基因whA编码的一种相对分子质量为50851的细胞外蛋白质，具有水溶性，由大多数致病菌株产生，能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(cHO)细胞，是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素，一直被认为是创伤弧菌重要的致病因子，且因其具有穿孔特性而颇受关注。目前对创伤弧菌溶细胞素的细胞毒性机制已有广泛研究和报道，但其确切机制尚未完全明了。为了给今后研究探讨创伤弧菌溶细胞素的致病机制以及制备创伤弧菌基因工程疫苗和免疫诊断试剂盒等奠定实验基础，本研究在我们实验室以往工作基础上，用工程菌BL2lDE39”32咿HhA表达

3、whA融合蛋白，对其进行纯化、复性；通过台盼蓝染料排斥试验检测vvhA融合蛋白对细胞活力的影响：分别以2，浙江大学硕士学位论文4．二硝基苯肼比色法和四苯硼钠法测定wlA融合蛋白对细胞LDH和站含量的影响；采用A衄eXinV．FITC／PI染色和流式细胞术检测并定量分析了w}A融合蛋白对细胞凋亡的作用：通过透射电子显微镜观察对whA融合蛋白引起细胞凋亡进行了定性研究；采用FIT℃．wlA融合蛋白荧光标记激光共聚焦技术对whA融合蛋白对细胞的作用进行了定位研究。实验方法采用本实验室构建的原核表达系统pE●32a(+)一whA．BL2lDE3，用IPTG诱

4、导whA融合蛋白表达后，以NTA．Ni亲和层析柱进行分离纯化，sDs．PAGE鉴定，并对纯化的whA融合蛋白进行透析复性、浓缩和滤过除菌。分别以一定浓度或～定时间的whA融合蛋白孵育、及分别以一定时间的whA融合蛋白与钾通道阻断剂四乙基铵(Ⅱ认)共同孵育体外培养的人脐静脉内皮(HuvEC)细胞，然后分别以台盼蓝染料排斥试验检测重组融合蛋白对细胞活力的影响，以2，4．二硝基苯肼比色法和四苯硼钠法分别测定重组融合蛋白对细胞U)H含量和C含量的影响，采用心)【inV-FITc伊I染色和流式细胞术对重组融合蛋白引起的细胞凋亡作定量分析，并通过透射电子显微镜观

5、察对重组融合蛋白引起的细胞凋亡作定性研究。用FIT℃标记纯化的vvlA融合蛋白，分别以一定的时间孵育体外培养的HuVEc细胞，最后激光共聚焦显微镜下观察FIT℃标记的vvbA融合蛋白在细胞中的分布情况。结果1．O、0．5和0．1nHnol／LIPTG均能很好地诱导重组wlA的表达，表达产物主要存在于菌体超声破碎物离心后的沉淀中，表达量高达细菌总蛋白的30％～40％。vvhA融合蛋白能引起HuVEC细胞活力的降低，其对HuvEC细胞的致死效应呈剂量依赖性，浓度在0．1m∥ml以上的vvhA融合蛋白处理HuVEC细胞，能使该细胞活力降低60％以上，与正常

6、对照细胞相比差异显著(PO．05)，whA融合蛋白单独处理和vvhA融合蛋白、TEA共同处理以及不同处理时间的各组HUvEC细胞培养液中K十浓度均明显增高(PO．05)。经vvhA融合蛋白处理的HUVEC细胞早期凋亡率2浙江大学硕士学位论文明显高于正常对照细胞(P

7、ⅣEC细胞出现典型的凋亡特征性形态学改变，但未发现有细胞坏死。正常HuvEc细胞和加荧光标记透析液孵育4小时的HIⅣEC细胞贴壁形态舒展，激光共聚焦扫描未见荧光。加荧光标记透析液孵育并以O．1m卧111未经荧光标记的whA融合蛋白处理4小时的HUvEc细胞体积变小、贴壁形态欠舒展，激光共聚焦扫描未见荧光。经O．1mg／mlFITC标记的whA融合蛋白分别以一定时间处理后的HUVEC细胞体积变小、贴壁形态欠舒展，激光共聚焦扫描细胞膜上及细胞内均可见到黄绿色荧光，且所见荧光呈非均匀性团块状分布。其中，处理2分钟、5分钟、10分钟和20分钟的细胞分别可见少

8、量荧光团，所见荧光团主要分布于细胞膜上及细胞内紧挨细胞膜内侧处，并见个别荧光团脱离内侧细胞膜而位于细胞内更中