重组创伤弧菌溶细胞素val201和va1289的突变对其活性影响的研究

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1、温州医学院硕士学位论文重组创伤弧菌溶细胞素Val201和Va1289的突变对其活性影响的研究姓名：郭雅君申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：楼永良；杜季梅2012-05重组创伤弧菌溶细胞素Val201和Val289的突变对其活性影响的韧I究目的：中文摘要l、研究突变重组创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriomutant，ArVvhA)对HUVEC细胞的细胞毒性作用。2、比较重组创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovu加ificUShemolysin，rVvhA)和ArVvhA对HUVEC的细胞毒性的作用。3、为探索天然创伤弧菌溶细胞素(Vibriov

2、ulnificushemolysin，VvhA)胆固醇结合功能模序提供实验依据。方法：l、利用突变PCR技术分别对预测的胆固醇结合功能模序中的第一个氨基酸组成部分进行突变Val201Gly、Val289Gly。2、诱导含pET-28a(+)vvhA和pET-28a(+)whAv201G’v289G重组质粒的BL21大肠杆菌表达融合蛋白rVvhA和rVvhAV201G,V289G。应用三步洗涤结合Ni2+亲和层析法对其进行纯化，利用稀释复性加分步透析相结合的方法进行蛋白质的复性。3、．复性后rVvhA和rVvhAv201G'V289G分别作用于HUVEC细胞，比较CCK．8测定细胞的存活率、瞬

3、间胞内钙离子浓度变化情况、细胞培养上清液中的钾离子浓度和流式细胞仪测定细胞凋亡和坏死率以及比较rVvhA和rVvhAV201G,V289G的溶血情况。结果：l、通过构建的pET-28a(+)vvhAv201G’V289G质粒酶切技术、菌落PCR技术和北京六合华大基因科技股份有限公司的测序结果证明rVvhAV201G,V289G突变成功。2、含pET．28a(+)vvhA和pET．28a(+)whAv201G,V289G重组质粒的BL21大肠杆菌经0．5mmol／LIPTG诱导后表达的融合蛋白Mr分别为54KDa和53KDa，电泳结果与融合蛋白的理论推算值基本相符。表达的蛋白质经三步洗涤与Ni

4、2+-NTA柱纯化的rVvhA和rVvhA-V201G'V289G稀释复性后证明具有溶血活性。3、比较rVvhA作用组和rVvhAV201G,V289G作用组，rVvhA作用HUVEC细胞抑制细胞增殖，降低细胞存活率，且呈剂量依赖性。rVvhA作用后，细胞内瞬间钙离子浓度增加，培养上清中钾离子浓度增加。而rVvhAV201G,v289G作用组细胞存活率明显增加，钙离子内流、钾离子外流和溶血活性均受到不同程度的抑制，流式测定结果可见，与rVvhA作用组比较，rVvhAV201G,V289G作用组诱导的细胞凋亡和坏死受到抑制。结论：rVvhA对HUVEC有毒性作用，引起钙离子内流、钾离子外流，进

5、而导致HUVEC的最终凋亡和坏死。将V201和V289突变后发现，HUVEC胞内钙离子浓度、钾离子外流显著减少，并且溶血活性也随之下降，rVvhAV201G,Vt289G所致的凋亡率和坏死率明显低于rVvhA组，说明预测的rVvhA胆固醇结合功能模序中非极性氨基酸缬氨酸影响细胞内离子的平衡。关键词：创伤弧菌；溶细胞素；HUVEC；胆固醇结合模序；突变2TheMutationofVal201andVal289InfluencestheActivityofRecombiantVibrioVulnificusHemolysinObjective-1．Toinvestigatethecelltoxi

6、cityofmutationrVvhAonHUVEC．2．TocomparethecelltoxicitybetweenrVvhAandmutationrVvhAonHUVEC．3．Topmvidetheevidencefortheresearchincholesterol—bindingmotifofVibriovulnificuscytolysin．Methods：1．TheresiduesVal-201andVal-289ofcholesterol—bindingmotifinrVvhAweremutatedtoGlyrespectivelybymutation-PCR．neprodu

7、ctwaspurifiedbymetalaffinitychromatographyusingNi计_NTAresin．Thepurifiedwererefoldedusingdilutionmethodscombinedwithstepdialysis．2．TheexpressionvectorpET．28a(+)whAandpET．28a(+)vvhAv201G，V289GinE．coliBL21(DE3