创伤弧菌溶细胞素膜成孔模序对细胞生物膜影响的研究

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1、万方数据论文题目：鱼』笾亟苴渣细胞塞腿盛王L撞庄过细胞生物堪髭喧的研究答辩委员会主席：答辩委员会成员：论文答辩日期：万方数据目录主塞摘兰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1苤塞擅垩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5笠二叠盆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7缱墨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一22笠三叠金⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．25结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32丝⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35叁耋塞丛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44兰塞童垒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

3、．45鲨剑：垦童明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56万方数据温州医学院硕士学位论文创伤弧菌溶细胞素膜成孑L模序对细胞生物膜影响的研究中文摘要目的：1、研究创伤弧菌溶细胞素膜成孔模序(rMpf)的成孔毒性和生物活性。2、研究rMpf对Hda细胞的生物膜功能和结构的影响。3、进一步完善创伤弧菌溶细胞素的结构功能研究和对创伤弧菌致病机制的深入研究，为细菌膜成孔毒素对分子致病机理研究提供科学依据，也为进一步研发阻断抗细菌成孔毒素毒力的药物奠定基础。方法：1、rMpf融合蛋白的表达、纯化和复性IPTG诱导含pET-28a(+)一mpf质粒的E．coliBL21(DE3)T程菌，表

4、达rMpf融合蛋白并用SDS．PAGE分析；三步洗涤法与N矽．NTA亲和层析法联合应用纯化rMpfi利用稀释复性与分步透析相结合的方案进行蛋白质复性。膜联蛋白．FITC／PI染色通过流式细胞仪检测复性后rMpf活性。2、rMpf融合蛋白对Hela细胞生物膜功能和结构的影响rMpf融合蛋白作用于Hela细胞，应用流式细胞术结合激光共聚焦显微镜技术观察DiI细胞膜荧光探针在rMpf作用后荧光分布的改变，MPTP检测线粒体膜通道孔的形成与变化，JC．1检测细胞线粒体膜电位变化，透射电镜技术观察细胞超微结构的改变。结果：1、rMpf融合蛋白的表达、纯化及复性含pET-28a(+)-mpf重组质粒的E

5、．coliBL21(DE3)通过O．5mmol／LIPTG诱导后，产生27kDa特异性表达条带，经三步洗涤与Ni2+-NTA柱纯化后的纯度约为95．0％。复性后rMpf作用Hela细胞，显示其具有较好的生物学活性和细胞毒性。2、rMpf融合蛋白对Hela细胞生物膜的功能和结构的改变rMpf可使Hela细胞的细胞膜结构发生改变，rMpf还可使Hela细胞的线粒体膜通道孔活性发生改变，造成MPTP开放，线粒体膜电位下降。rMpf作用Hela细胞后其细胞膜和线粒体等一系列细胞器发生明显的形态学改变，提示细胞可能已经发生凋亡或坏死。结论：本实验结果表明，rMpf不仅能聚集结合在细胞膜上，还可在与细胞

6、膜短暂接万方数据触后进入细胞内发挥毒性作用，同时还可对线粒体膜造成一定损伤，促使线粒体膜通道开放，膜电位下降。我们推测，作为WC的膜成孔多肽，rMpf可能是通过与生物膜上的胆固醇结合而发挥作用，还有待进一步验证。关键词：生物膜；细菌成孔毒素；线粒体；胆固醇2万方数据温州医学院硕士学位论文AStudyontheEffectsofMpfMotifofVibriovulnificuscytolysinonCellularMembraneABSTRACTobjective1、TostudytheporeformingcytotoxicityandbiologicalactivitybyRecombi

7、nantFusionProteinrMpfofVibriovulnificuscytolysin．2、ToinvestigatethefunctionandcellmorphologyofmembraneOnHelacellsbyRecombinantFusionProteinrMpfofVibriovuln矿cuscytolysin．3、TofurtherstudythestructuralofVVCand