重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

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1、重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备：张琦，卢改娜，谢旦立，甄伟春，楼永良【摘要】目的?：制备重组创伤弧菌溶细胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)鼠源性单克隆抗体，并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定，为创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC，将rVVC纯化

2、、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株，有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型，ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后，经ELISA检测，血清有效稀释度达1:12?800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为B2C7和E3F4株，其抗体类型均为IgG1，且具有较高特异性，与多种其他细

3、菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠，获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，抗体类型为IgG1型。【关键词】创伤弧菌;溶细胞素;vvhA基因;杂交瘤;单克隆抗体　　Abstract:?Objective:Mouse-originalmonoclonalantibodyagainstrebinantVibriovulnificuscytolysin(rVVC)munoglobulinentofrapiddetectionkitofVi

4、briovulnificuscytolysin.Methods:?IPTGmuneBALB/c.TheeffectsofexpressionandpurificationofrVVCinedbySDS-PAGE.Thehybridomacelllinestosecreteanti-rVVCmonoclonalantibodiesatechniqueandELISA，andtheniteddilution.Doubleimmunodiffusionassayonoclonalantibody.EL

5、ISAanddoubleimmunodiffusionassayinethespecificity.Results:?ThemiceimmunizedbyrVVCdilutionto1:12?800byELISA.Taonoclonalantibodies.Themonoclonalantibodiesshootherbacteria.Conclusion:?BALB/cmiceissuccessfullyimmunizedandtouse-originhybridomacelllinesnam

6、edB2C7andE3F4onoclonalantibodiesagainstrVVCareacquired.ThetypeofmonoclonalantibodyagainstrVVCisIgG1.　　Keya;monoclonalantibody　　创伤弧菌(Vibriovulnificus，Vv)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，主要存在于海水及海产品中，可引起原发性败血症和严重的创口感染[1-2]。近几年，浙江沿海、深圳也时有报道该菌感染病例，已引起很多专家学者关注。创伤弧菌可能包含诸多毒

7、力因子[3]，溶细胞素是其唯一分泌至胞外具有种特异性的膜成孔类外毒素[4]，可作用于多种靶细胞诱导细胞凋亡、坏死，引起细胞炎症反应等[5-6]。此外，体外重组的创伤弧菌溶细胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)亦具有典型的细胞毒活性，能引起人ECV304细胞凋亡[7]，诱导人SMMC7721细胞产生细胞应激，上调其TNF-α和HSP90的表达[8]。目前，有关创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)抗体的研究较少

8、，姚蔚等[9]曾利用体外rVVC制备了其多克隆抗体，并证实该多抗能阻断rVVC对SMMC7721的细胞毒作用，为保护性抗体。而单克隆抗体相比多克隆抗体，具有更高的特异性。因此，本研究中，我们采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化原核表达的rVVC，采用杂交瘤技术制备鼠源性rVVC单克隆抗体并进行免疫学鉴定，以期为VVC致病机制的深入研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素的快速检测试剂盒研发奠定基础。　　1??材料和方法　　1.1??材料　　1.1.1??细胞系、菌种及质粒：小鼠骨髓瘤SP2/0细胞