重组创伤弧菌溶细胞素对nf--κb信号通路影响的研究

《重组创伤弧菌溶细胞素对nf--κb信号通路影响的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、温州医学院硕士学位论文重组创伤弧菌溶细胞素对NF--κB信号通路影响的研究姓名：屠艳烨申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：楼永良；杜季梅2012-05温州医学院硕士学位论文重组创伤弧菌溶细胞素对NF．KB信号通路影响的研究中文摘要目的：l、研究重组创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovulnificushemolysin，rVvhA)对THP．1细胞的影响。2、研究rVvhA作用THP．1细胞后NF．rd3信号通路的影响。3、进一步探索创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovulnifiCUShemo

2、lysin，rVvhA)的致病机制，为临床诊治提供基础科研依据。方法：1、创伤弧菌溶细胞素融合蛋白rVvhA冷冻干燥成粉末，一70"C保存。2、CCK．8法检测rVvhA对THP．1细胞增殖的抑制作用。3、倒置显微镜观察rVvhA作用THP-1细胞后细胞形态学变化。4、激光共聚焦显微镜观察THP一1细胞内NF．r,Bp65核转移情况。5、流式细胞仪检测rVvhA作用后THP一1细胞细胞内总NF．r．Bp65表达情况。6、WesternBlot检测rVvhA作用THP—l细胞后细胞核内NF．r．Bp65的表达量7、酶联免疫吸附法检测rVvhA作

3、用THP一1细胞后细胞肿瘤坏死因子0【(tumornecrosisfactor．a、TNF．0【)和白介素6(interleukin．1、IL．6)表达含量的变化。8、酶联免疫吸附法检测加入NF．r．B抑制剂BAYl1．7082和PDTC后，细胞肿瘤坏死因子0【和白介素6表达含量的变化。结果：l、诱导表达的融合蛋白rVvhA的分子量约为54kDa，电泳结果与该融合蛋白的理论推算值基本相符。表达的融合蛋白经三步洗涤与Ni2+-NTA柱纯化后，其纯度达90．0％左右。纯化的rVvhA稀释复性后证明具有溶血活性。2、rVvhA对THP．1细胞的生长

4、抑制呈时间一剂量依赖性，镜下可见细胞出现明显的形态学改变。3、激光共聚焦显微镜观察0．4HU／mLrVvhA作用6h后，THP．1细胞内NF—rd3p65的核转移现象最明显。4、倒置显微镜观察表达出来的rVvhA融合蛋白作用THP．1细胞后，能够使细胞产生形态学变化。5、流式细胞仪检测结果显示0．6HU／mLrVvhA作用2h后，细胞内总的NF．rd3p65表达量达到高峰。2温州医学院硕士学位论文6、Westernblot检测显示0．6刖／mLrVvhA作用4h时，细胞核内NF．r,Bp65蛋白含量最高。7、ELISA结果显示TNF．a的表达

5、在rVvhA作用范围内呈时间一剂量依赖性；IL．6在0．6HU／mLrVvhA作用时表达最高，随后随着浓度的增加反而下降。8、NF-r,B抑制剂能使IL-6表达量下调，但对TNF．C【的表达无明显影响。结论：实验证明rVvhA对nD-1细胞有细胞毒性作用，能够抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性rVvb．A作用THP．1细胞后能影响NF．r,B信号通路，并能上调细胞n盯．0L、IL-6的表达，且NF．r,B抑制剂能够下调细胞IL．6的表达。关键词；创伤弧菌：溶细胞素；重组创伤弧菌溶细胞素：人单核细胞系(THP．1细胞)；NF-r,Bp65：TNF．a

6、：IL．6温州医学院硕士学位论文TheroleofrVvhAeffectedonNF—rd3SignalingPathwayABSTRACTObjective：1．ToinvestigatethecelltoxicityofrecombinantVibriovulnificushemolysin(rVvhA)onTHP．1cells．2．ToinvestigatewhetherrecombinantVibriovulnificushemolysin(rVvhA)mayactiveNF-r,．BsignalingpathwayinthePMA·

7、stimulatedTHP-1cellline．3．TOprovideexperimentevidenceforcytolyticactivitymechanismofFibr／ovutnificuscytolysin．Methods：1．mexpressionvectorpET-28a(+)vvh．4wasinducedbyIPTGtoexpressthevvhArecombinantprotein(rVvhA)inE．coliBL21(DE3)．，nleexpressedproductWaspurifiedbymetalaffinityc

8、hromatographyusingNi计-NTAresin．，nlepurifiedrVvhAwererefoldedusingdilutionmethodsco