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1、基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达【摘要】目的：对创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白表达条件进行优化，从而获得高效稳定的金属蛋白酶原核表达系统。方法：质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计，对结果进行直观分析及方差分析，并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果：直观分析表明摇菌转数的R值最大，其次为诱导时间和诱导温度，诱导剂IPTG浓度的R值
2、最小；方差分析表明摇菌转数的P值小于0.05，而时间因素、温度及IPTG浓度的P值均大于0.05。结论：摇菌转数为主要因素（其为250r/m时,表达水平最高），其次为诱导时间，而诱导温度和诱导剂IPTG浓度对实验结果影响不明显。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下，金属蛋白酶的表达量高达40.67%。【关键词】创伤弧菌；金属蛋白酶；正交设计；直观分析；方差分析 AbstractObjective:Tooptimi
3、zetheexpressionofrebinantmetalloproteaseofVvibriovulnificusinE.coliBL21/DE3inducedbyIPTG.Method:TheplasmidofpET-32a-vvp/E.coliBL21e,temperature,agitationspeedandconcentrationofIPTG,entaldesign.Thedataethod.Results:TheRvalueofagitationrateresultingfromdir
4、ectcalculationongfourfactors.ThePvalueofagitationratearkableaffectedbytheagitationrate.TheexpressionlevelofVVPproteinishighest.Thereforeethodforhigh-levelexpressionofVVP-fourhours-inducingtime,37℃-inducingtemperature,1mmol/LconcentrationofIPTGandagitatio
5、nratein250rpm.Keyetalloprotease;orthogonalexperimentaldesign;directanalysis;analysisofvariance(ANOVA)很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌（Vibriovulnificus,Vv）污染的食物或者皮肤破损接触Vv均可引起Vv感染，主要表现为严重的蜂窝组织炎和败血症〔1~3〕。一旦出现败血症，其死亡率高达50%以上〔4~6〕。因其病情凶险,故对创伤弧菌感染的临床早期快速诊断尤为重要。目前,Vv的致病
6、机制尚未明了。但有研究表明该菌分泌的金属蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性损伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主要毒力因素之一〔7~9〕，并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株之间具有高度保守性。故金属蛋白酶可作为创伤弧菌感染重要的临床实验室检测靶标。而要制备以VVP为靶标的Vv免疫检测试剂盒，首先必须获得作为足量高纯度的VVP抗原来制备抗体。但是金属蛋白酶作为创伤弧菌种特征性的外毒素，其自然分泌产量并不高,且由于方法学的限制,采用常规生化方法获得足量高纯度溶细胞素相当困难。而通过基因工程的方法，我们
7、可以在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质，对其应用或进行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的诱导表达受很多因素的影响，例如，诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌的转数等。因此，如何得到一种最佳的诱导条件组合，从而使蛋白高效稳定的表达是我们研究的基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株和质粒 原核表达载体pET-32a-vvp由本课题组构建；宿主菌E.coliBL21/DE3由南方医科大学公共卫生与热带医学学院吴昆博士惠赠。 1.1.2诱导剂IPTG和筛选用氨苄
8、青霉素 购自鼎国生物制品有限公司。 1.2方法 1.2.1实验设计 针对诱导过程中对菌体表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用SPSS11.5统计学软件进行正交实验设计。因素及水平见表1。表1因素水平表（略） 1.2.2诱导 质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后,挑取单菌落接种于含氨卞青霉素(100mg/L)的LB培养基中,37℃活化过夜,次日按1:100的比例
