融合蛋白表达实验报告_图文

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1、基因构建与表达实验报告实验一目的基因扩增与纯化回收聚合酶链式反应实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来,获得足量的目的片段。实验原理：DNA双螺旋fk90-95°C解链形成单链；50-55°C引物与单链结合；70-72°CTaqDNA聚合腮从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5，—3,方向合成新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头实验试剂：双蒸水(ddH2O)lOxPCR缓冲液(含Mg2+)4利'lOxdNTP混合Taq酶(EasyTaq)

2、DNA模板两种引物(上游和下游)实验步骤：1、配制PCR反应体系试剂ddH20EasyTaqBufferdNTPEasyTaq酶日•油上游引物下游引物DNA模板lOOul人6510100.210222体系注：一般情况下先依次加入ddH2O、10xBuffer>lOxdNTP、EasyTaq酚、LT油配体系分装到PCR管中(lOOul/管)，再加入对应的上下游引物和模板2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR,反应参数如下：(1)94°C预变性4min；(2)94°C变性lmin；(3)55°C退火1.5min；(4)72°C延伸2min；(5

3、)重复(2)・(4)30个循环；(6)72°C终延伸lOmin；二、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的:通过琼脂糖凝胶电泳检测dna分子量的大小,检测n的基因片段是否扩增出来。实验原理：DNA分了在琼脂糖凝胶中泳动时冇电荷效应和分了筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用卜-朝正极移动。在琼脂糖凝胶屮电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子山于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分了虽大小得到冇效分离。漠化乙锭(EB)可插入到DNA分了的相邻碱基Z间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。实验仪器：

4、电泳仪、紫外检测仪、水平电泳杷I、移液枪、一次性手套实验试剂：TAE、EB溶液、凝胶加样缓冲液、琼脂糖实验步骤：1、1%琼脂糖凝胶的制备(以制备5块胶为例)：（1）称取琼脂糖1.6g,加入160ml1xTAE缓冲液，在微波炉上加热溶解煮沸熔化，取出摇匀至无沉淀。（2）取有机玻璃内槽，放直于水平位證，用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。冷却到60C左右（手感温度不烫手即可）加入7ulEB溶液，摇匀后倒入有机玻璃内槽，等距插入5个样品梳了。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液没过胶面。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点3

5、ul缓冲液在点样板上，再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液混匀示，加入样品孔屮，并记录好点样顺序。（人体系PCR产物需要回收，点样时更换枪头避免交叉污染）3、电泳及结果观察接通电泳杷与电泳仪的电源，170V恒压电泳20min,电泳至漠酚蓝接近胶底部边缘即可；电泳完毕，取出凝胶，放在紫外灯卜•观察DNA条带的位置，根据DNA条带与澳酚蓝的相对位置估算DNA分了量大小，记录结果。三、DNA片段回收：1、摇匀GS树脂，川移液枪取500ul树脂分装于1.5mlEP管中，将PCR人体系产物加入到GS树脂中,用移液枪吹打混匀,静置lOmin,让片段结合到GS

6、树脂上2、将混合液转入纯化柱中，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体3、加600ul80%异丙醉洗脱两次，13000rpm瞬时离心,弃收集管11诫体，13000rpm空甩20min；収出回收柱放入T净的1.5mlEP管中，放入30/0摄氏度烘箱烘TlOmin左右，使界丙醇完全挥发。4、取出加入50ulddH2O浸润树脂干粉，静置lOmin让ddH2O充分浸润树脂干粉，13000rpm离心2・3mim得到的PCR产物用于双酶切。实验结果：序号引物号lOOul大体系20ul小体系片段大小1P18279V3272P18280V3393P18281V3

7、784P18282V3215P18283V5526P18284V2317P182852228P18286XV3279P1828750110P18288XX52811P18290V47112P18291V35113P18292V18614P1929364515P18295XX87316P18296V61217P1829724318P18298V41719P1829990320P18300V24921P18302V28522P18303V30023P18304V30624P18305V34525P18289V18626P18274V489实验二DNA双

8、酶切及酶切产物纯化实验目的：通过DNA限制性内切酶对DNA双链进行双酶切，使DNA片段鉤出相应的粘性末端。实验原理：1、核