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1、基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达论文【摘要】目的：对创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白表达条件进行优化，从而获得高效稳定的金属蛋白酶原核表达系统。方法：质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计，对结果进行直观分析及方差分析，并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果：直观分析表明摇菌转数的R值最大，其次为诱导时间和诱导温度，诱导剂IPTG浓度的
2、R值最小；方差分析表明摇菌转数的P值小于0.05，而时间因素、温度及IPTG浓度的P值均大于0.05。结论：摇菌转数为主要因素（其为250r/m时,表达水平最高），其次为诱导时间.freel、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下，金属蛋白酶的表达量高达40.67%。【关键词】创伤弧菌；金属蛋白酶；正交设计；直观分析；方差分析AbstractObjective:TooptimizetheexpressionofrebinantmetalloproteaseofVv
3、ibriovulnificusinE.coliBL21/DE3inducedbyIPTG.Method:TheplasmidofpET-32a-vvp/E.coliBL21e,temperature,agitationspeedandconcentrationofIPTG,entaldesign.Thedataethod.Results:TheRvalueofagitationrateresultingfromdirectcalculationongfourfactors.ThePvalueofagit
4、ationratearkableaffectedbytheagitationrate.TheexpressionlevelofVVPproteinishighest.Thereforeethodforhigh-levelexpressionofVVP-fourhours-inducingtime,37℃-inducingtemperature,1mmol/LconcentrationofIPTGandagitationratein250rpm.Keyetalloprotease;orthogonalex
5、perimentaldesign;directanalysis;analysisofvariance(ANOVA)很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌（Vibriovulnificus,Vv）污染的食物或者皮肤破损接触Vv均可引起Vv感染，主要表现为严重的蜂窝组织炎和败血症［1~3］。一旦出现败血症，其死亡率高达50%以上［4~6］。因其病情凶险,故对创伤弧菌感染的临床早期快速诊断尤为重要。目前,Vv的致病机制尚未明了。但有研究表明该菌分泌的金属蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性损
6、伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主要毒力因素之一［7~9］，并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株之间具有高度保守性。故金属蛋白酶可作为创伤弧菌感染重要的临床实验室检测靶标。而要制备以VVP为靶标的Vv免疫检测试剂盒，首先必须获得作为足量高纯度的VVP抗原来制备抗体。但是金属蛋白酶作为创伤弧菌种特征性的外毒素，其自然分泌产量并不高,.freelg/L)的LB培养基中,37℃活化过夜,次日按1:100的比例转接,37℃培养至OD600约0.8时即根据不同诱导条件进行诱导,诱导条件见实验设计。离心收集菌体,做SDS
7、-PAGE分析,考马斯亮蓝染色、脱色后观察。扫描后运用图像分析软件QuantityOne得出各不同诱导条件下融合蛋白VVP的表达浓度。1.2.3正交试验直观分析法分别计算每个因素各水平下的平均收率，用各因素各个水平平均收率的极差R(极差=平均收率的最大值-平均收率的最小值)来反映各因素的水平变动时对试验结果影响的大小［10］。1.2.4方差分析运用SPSS11.5统计学软件对正交设计资料进行分析。1.2.5结果验证在由上述方法得出的最佳诱导条件下，对转化了质粒pET-32a-vvp的E.coliBL21
8、/DE3进行诱导，并对结果进行SDS-PAGE分析，以验证此组合的诱导条件的诱导表达效果。并设置转化空载体组及未诱导组进行对照。2结果2.1SDS-PAGE结果取16组经不同诱导条件诱导的菌液作组间平行SDS-PAGE,经QuantityOne对染色凝胶做图像分析,来确定融合蛋白VVP表达的相对比例。SDS-PAGE结果见图1，图上方的数字代表组别。经扫描得到各组VVP的表达比例见表2。2.2优化结果2.2.1正交试验直观分析法运用正交试验
