副溶血弧菌耐热溶血毒素(TDH)抗肿瘤作用研究

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1、学校代码：10264研究生学号：上海海洋大学硕士学位论文题目：副溶血弧菌耐热溶血毒素（TDH）抗肿瘤作用研究英文题目：Studyontheantitumoreffectofvibrioparahaemolyticus(TDH).专业：研究方向：姓名：指导教师：二O一八年四月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意

2、识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日副溶血弧菌耐热溶血毒素（TDH）抗肿瘤作用研究摘要近年来，由于手术、放疗、化疗等肿瘤治疗手段

3、的局限性，寻找新的治疗途径迫在眉睫，而生物毒素抗肿瘤则为治疗癌症提供了新的方向，通过对生物毒素进行修饰，可以靶向性的针对一些癌症病例的治疗。本文以TDH为研究对象，围绕TDH的提取纯化、TDH对不同细胞相对活力的测定、TDH的抗肿瘤作用以及TDH抗肿瘤机制的初步探索这四个部分展开实验，以期研究TDH的抗肿瘤作用以及机制。主要研究内容如下：1、通过对副溶血弧菌进行活化，将细菌培养液通过硫酸铵盐析、透析、葡聚糖凝胶层析、超滤膜浓缩进行分离，提取与纯化，得到纯度较高的TDH。利用SDS-PAGE电泳和溶血实验鉴定TDH的分子条带和生物活性，考马斯亮蓝法测定其浓度。结

4、果显示：优化方法之后可从1.5L细菌培养液中得到14mg纯化较高的TDH。2、MTT法测定SPC-A-1、Hela、7721、NCM460和LO2这几株细胞的相对活力。测定其IC50，筛选出对TDH较为敏感的细胞进行实验。结果显示：TDH处理SPC-A-1、7721、Hela、NCM460和LO2细胞24h之后的IC50值分别为6.7μg/mL、47.3μg/mL、29μg/mL、151μg/mL、118μg/mL。由此可知，TDH对肿瘤细胞的毒性远大于正常细胞，对肿瘤细胞具有选择性。3、MTT法检测TDH对SPC-A-1和Hela细胞的生长曲线的影响；“创伤

5、实验”检测TDH对SPC-A-1细胞迁移能力的影响；细胞克隆实验检测TDH对SPC-A-1细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测TDH对SPC-A-1和Hela细胞周期、AnnexinV-FITC、PI染色后的细胞凋亡的影响。结果显示：TDH能够剂量依赖性的抑制这两株肿瘤细胞的生长、增殖、迁移，能够在不同时期对肿瘤细胞发生阻滞作用，抑制肿瘤细胞的生长。同对照相比，我们可以看到TDH能够很显著的诱导细胞早期凋亡，如用5μg/mL的TDH处理SPC-A-1细胞24h，早期凋亡率达到33.3%。4、流式细胞术检测TDH对SPC-A-1和Hela细胞的线粒体膜电位的影响；

6、试剂盒检测TDH引起SPC-A-1和Hela细胞中caspase-3活化程度的变化情况。结果显示：对于这两株细胞，在相同药物浓度的处理下，TDH能够较明显的诱导细胞凋亡，但线粒体膜电位却没有发生变化，而Caspase-3的活化程度随着处理时间的延长有一个较明显的增强，说明了TDH诱导肿瘤细胞凋亡与线粒体途径没有关系，与Caspase-3的活化有着密切联系，为下一步细胞膜表明死亡受体途径的研究提供了科学的依据。关键词：副溶血弧菌耐热溶血毒素（TDH），细胞毒性，抗肿瘤作用，细胞凋亡StudyontheantitumoreffectofVibrioparahaem

7、olyticusthermostablehemolysin(TDH).ABSTRACTInrecentyears,duetothelimitationsofsurgical,radiotherapy,chemotherapyandothermethodsofcancertreatment,findingnewwaysoftreatmentisimminent,whilebiotoxinantitumorprovidesanewdirectionforthetreatmentofcancer.Bymodifyingthebiologicaltoxins,thet

8、reatmentofsomecance