xenorhabdus stockiae溶血素基因的克隆、表达及其活性研究

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1、万方数据分类号Q塑!!!学校代码10542密级学号公开20l102141261XenorhabdusStockiae溶血素基因的克隆、表达及其活性研究Cloning，ExpressionHemolysinGenefromXenorhabdusStockiaeanditsBiological’Activities研究生姓名李岚岚指导教师姓名、职称张友明教授学科专业研究方向微生物学微生物DNA工程湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一四年十二月万方数据摘要致病杆菌(Xenorhabdussp．)与昆虫病原线虫一一斯氏线虫(Steiner

2、nema)互惠共生，存在于昆虫病原线虫肠道内，属肠杆菌科，具有广谱高效杀虫、抑菌及抗肿瘤等生物活性，在体外培养过程中会发生可逆的型变，根据表型不同被分为初生型(I型)和次生型(II型)。嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophila)的溶血素XhlA是一种细胞表面溶血素，可以降解昆虫的两种主要免疫细胞(浆血细胞和粒性白细胞)，而且溶血素XhlA对菌株高效杀死烟草天蛾(Manducasexta)幼虫是必要的。XenorhabdusStockiaeHNxs01是本实验室从湖南省分离出来的一株新的昆虫病原线虫共生菌，此菌种在

3、世界范围内鲜有报道，其天然产物具有较强的杀虫、抑菌与抗肿瘤活力。本研究针对性的以致病杆菌HNxs01菌株的基因组为模板，以t-INxs01菌株溶血素基因序列设计引物，PCR扩增获得了溶血素基因xhlA，克隆至诱导表达载体pET28a中。将含溶血素基因的表达载体pET28a-xhld转化至大肠杆菌Rosetta(pET28a-xhlA)dp，通过IPTG诱导表达了溶血素蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检测结果显示，表达的重组蛋白约为155kDa，通过液相色谱．质谱(LC．MS)进一步鉴定了表达的溶血素蛋白。通过对初始诱导时

4、机、诱导时间、IPTG浓度、诱导温度等条件的优化研究，发现重组菌的最佳诱导条件为：37℃发酵2h后，加入O．1mmol／L的IPTG，37"C诱导4h，可万方数据获得高效表达。进一步检测重组工程菌的溶血活性和磷脂酶活性，发现其超声破碎后的上清液对兔血细胞有较强的溶血活性，也能水解卵磷脂，表明工程菌能诱导表达具有溶血活性和磷脂酶活性的溶血素蛋白。同时，抗肿瘤活性检测发现重组工程菌异源表达产物对小鼠乳腺癌4T1细胞人有微弱的抑制作用，而对人肝癌Hep．3B细胞和小鼠黑色素瘤B16．F10细胞无明显的抑制作用。对从大蜡螟尸体内分离到的致病

5、杆菌HNxs01新菌株全基因组测序，进行序列分析，获得了溶血素基因，并在大肠杆菌中成功表达了具有溶血活性的溶血素蛋白，摸索出了最佳的表达条件，成功地建立了溶血素的表达体系。为进一步纯化出致病杆菌溶血素蛋白提供了前期研究基础，为研究致病杆菌的共生与致病机理及溶血素的应用打下了坚实的基础。关键词：致病杆菌、溶血素、异源表达、溶血活性、诱导条件II万方数据ABSTRACTXenorhabdussp．whichformmutualisticsymbioseswiththeentomopathogenicnematodes(EPN)Stein

6、ernemaandcolonizetheintestineofthenematodes，aretheGram—negativebacteriaofthefamilyofEnterobacteriaceae．Thesebacteriashowmultiplebioactivitiessuchasbroad-spectrumandhighefficientinsecticidalactivities，aswellasantimicrobialandantitumor．Becasusereversiblephenotypicchanges

7、(whichcalledphasevariants)mayoccurwhentheyareculturedinvitro，thesebacteriaaredividedintoprimaryform(phaseI)andsecondaryform(phaseII)basedondifferentphenotypes．TheproteinXhlAofXenorhabdusnematophilaisacell—surfaceassociatedhaemolysinthatcanlysethetwomajorprevalenttypeso

8、finsectimmunecellsplasmatocytesandgranulocytes，andXhlAisrequiredforfullvirulencetowardsManducasextalarvae．Xenorhabdus