大豆MYB转录因子基因的克隆及其表达研究

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1、四川农业大学博士学位论文大豆MYB转录因子基因的克隆及其表达研究姓名：杨文杰申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：杨婉身;唐益雄20070601摘要通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达，是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。MYB转录因子基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用。大豆是重要的油料作物，同时也是蛋白和异黄酮的重要来源，而大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。因此，本文以大豆为研究材料

2、，从中分离克隆新的MYB转录因子基因，以期为MYB转录因子在类黄酮的生物合成调控及其胁迫应答等方面的研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下：1．根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物，以大豆品种中豆27、吉林3号、淮豆l号及张家口黑豆的叶片为材料，RT-PCR扩增出14个MYB基因同源片段；据此设计基因特异引物，通过RACE-PCR分离克隆出4个MYB转录因子基因，GmMYBZ](D0902862)、GmMYBZ2(D0902861)、GmMYBJd(D0902863)和GmMYBJ7(DQ902864)；氨基酸序列比对表明，这4个基因

3、分别具有两个MYB结构域，为典型的R2R3MYB转录因子基因。2．半定量RT-PCR对这4个基因的组织特异性表达情况进行了检测，结果只在叶片中检测到了GmMYBJ6的表达，在茎和叶中分别检测到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表达，而GmMYBZ2在植物的根、茎、叶及未成熟种子中均有表达。对胁迫应答的检测结果显示，在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)条件下，随着处理时间的增长，GmMYBJ6的表达量增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表达量降低。3．以基因组DNA为模板对GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYRl6和GmMYBJ7进行了PCR扩增，

4、扩增产物经序列分析表明，GmMYBZI不含内含子，GmMYBZ2含有1个内含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分别含有2个内含子。4．构建四个酵母效应质粒pBridge-GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge,-GmMYBJ6和pBfidge．GmMYRl7，转入酵母菌株AHl09中，并分别在缺少色氨酸的sD培养基和缺少色氨酸、组氨酸的SD双缺陷培养基上筛选阳性转化子。酵母表达表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7均具有明显的转录激活功能，p·半乳糖苷酶活性分别为10．35U、28．48U和24．31U，Wha

5、t-man滤纸显色反应均能呈现出明显的蓝色；l而GmMYBZl酵母转化株的13．半乳糖苷酶活性仅为3．59U，Whatman滤纸显色反应未能呈现出明显的蓝色。5．构建绿色荧光蛋白融合表达载体，基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达，结果表明，C．maMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均定位于细胞核中，与亚细胞定位预测一致。6．构建植物表达载体pCAMBIA2301．GmMYBZ2、pCAMBIA2301一GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，利用农杆菌介导法转化烟草NC89；通过Kan抗性、Gus染色及RT-PCR筛选鉴定

6、阳性苗；RT-PCR检测结果显示，GmMYBJ6可提高类黄酮代谢途径中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸4．羟化酶(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、黄酮醇合成酶ffLS)等关键酶的表达，结果在GmMYBJ6表达的烟草中，总黄酮含量增加；而由于GmMYBZ2和GmMYBJ7抑制了多数类黄酮代谢途径中基因的表达，从而导致转化烟草中总黄酮含量减少。耐胁迫检测结果表明，GmMYBJ6在烟草中的表达，增强了转基因烟草对UV-B、高盐及干旱等非生物胁迫的耐受性。关键词：大豆；MYB转录因子；酵母表达；亚细胞定位；类黄酮；转

7、基因烟草；基因表达调控ⅡAbstractTranscriptionfactorsplayanimportantroleinregulationofplantgrowthandphysiologicalmetabolismbyregulationofgeneexpressionatthen'anscriptionlevel，MYBtranscriptionfactorgeneisoneofthelargestfamiliesinplants，whichinvolvedinregulationofsecondarymetabolism，respondin

8、gtohormonesandenvironmentalfactors，alsoregulationofcel