人胸腺素α原基因的克隆表达及其生物活性的初步研究

《人胸腺素α原基因的克隆表达及其生物活性的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、厦门大学硕士学位论文人胸腺素α原基因的克隆表达及其生物活性的初步研究姓名：李俊燕申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：周克夫20070601厦门大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本入完全意识到本声明的法律结果由本人承担。声明入(签名)：套俊撬日期：力伽7年占月玉，日厦门大学学位论文著作权使用声明本人完全了解厦门大学有

2、关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。l、保密弋彩在&年解密后适用本授权书。2、不保密k／日期：撕：71年I；月拍日期：29中多月j／日摘要摘要Goldstein等于1966年自小牛胸腺中首次提取到具有免疫调节活性的物质，并命名为胸腺素。其后经过30余年的临床研究，一些胸腺激素或胸腺肽制剂已作

3、为一种免疫调节剂类药物广泛应用于临床，在治疗或减轻原发性免疫缺陷、病毒或细菌感染、自身免疫和癌症等疾病方面取得了较好的疗效。目前临床上所用的胸腺素主要是由小牛胸腺中纯化得到的胸腺素F5组分(thymosinfraction5，TF5)，其中含有40余种肽类，相对分子质量为1000--15000Da。胸腺素a原(prothymosinObProTa)的N端含有完整的胸腺素al(thymosinOtl，Ta1)28肽。ProTa具有与TQl相似甚或更高的免疫调节活性。由于在免疫和细胞生长调控方面的广泛作用，ProTa在其被发现后的20多

4、年里，一直作为胸腺素家族中的研究重点而备受人们的关注。本实验从中国人外周血中提取总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，设计引物，利用PCR技术扩增出ProTo基因，将成熟ProTa的编码框序列构建到原核表达载体pGEX6P-l中，在氨苄青霉素平板上筛选抗性转化子，并经PCR，双酶切鉴定，挑选出阳性克隆子，DNA钡Y序正确，表明成功地构建了原核表达载体pGEX-a。将重组载体pGEX-礤化宿主菌BL21(DE3)，异丙基一13一D--半乳糖(IPTG)诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE分析鉴定目的蛋白，分析发现与预期外源目的基因表达

5、产物相当的37KD左右增加了一条特异蛋白条带，且目的蛋白是以可溶的形式表达，凝胶成像仪分析其表达量高达27．9％。用亲和层析分离纯化后的ProTo融合蛋白作为抗原，与完全弗氏佐剂完全乳化，采用腋下多点注射免疫的方法免疫新西兰大白兔，经过31天的免疫，获得兔抗ProTa的多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法，测得抗体效价超过1：51200，蛋白印迹(Westernblot)分析结果显示，该抗体能特异性与ProT诫原产生明显免疫亲和反应。体内抗肿瘤实验显示，该融合蛋白在1．0-0．0001肛g／只范围都具有明显抑$J]S1

6、80在小鼠皮下的生长，尤其对已经腹水接种S180细胞的荷瘤小鼠再皮下注射重组融合蛋白，0．0001pg／只的浓度并具有显著延长小鼠寿命的效果，尤其是1fag／只浓度以上的剂量即可达到超过60天，并且完全存活的效果。在抗氧化能力活性检测中，选择4个月龄，体重在40克以上的老龄老鼠进行实验，通过注射重组融合蛋白，不仅摘要可以显著提高老鼠的胸腺指数，同时可以显著提高老鼠抗氧化能力。本研究采用GST原核表达系统克隆表达融合蛋白ProTa，制备了兔抗ProTcr多克隆抗体，所制备的抗体具有很强的灵敏性和特异性，初步探索重组ProT0f的抗肿瘤

7、，抗氧化及延长荷瘤小鼠寿命等生物活性，获得具有生物活性的ProTtY融合蛋白，为进一步研究开发ProTa的生物药品奠定了基础。关键词：ProTc☆克隆表达；抗S180肉瘤；延长寿命；抗氧化2ABSTRA(了rABSTI认CTGoldsteinfirstlyisolatedsubstancefromcalfthymus，namedthymosinwhichCalltakeonimmunityregulationactivityin1966．After30years’clinicstudy,thymosinwasappliedtocli

8、nicasimmunityregulator．Severaldescriptionsofitseffectsarisedailypointingtoallessentialroleintreatingoralleviatingorig