粪肠球菌esp基因克隆、原核表达及其蛋白初步研究

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1、分类号——ICS学校代码!Q!圣鱼学号窒鳗旦鲤!盟蒌i萋～茎一3墓蒙葛民熬大学硕士学、．文粪肠球菌esp基因克隆、原核表达及其蛋白初步研究EnterococcusEaecalisEspGeneCloning，ProkaryoticExpressionandProteinCharacteristicsPreliminaryResearch申请人：董国军学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病的分子流行病学和防制新方法研究学位类别：学术学位指导教师：高原教授论文提交日期：二O一二年五月摘要目的：构建内蒙古鹅源粪肠球菌分离菌株，表面蛋白esp基

2、因的原核表达载体，并在BL21大肠杆菌中表达。对所表达的目的蛋白的免疫原性和反应原性以及其蛋白的初步应用进行研究。方法：构建分离菌株esp基因的原核表达载体，诱导并纯化蛋白后对所纯化的目的蛋白进行初步分析：对粪肠球菌分离菌株和标准株的DNA总基因组进行提取。依据Genebank中公御的esp基因碱基序列，应用Primer5．0引物设计软件，设计一对esp基因特异性引物。经PCR扩增分离菌株esp基因片段，琼脂糖凝胶电泳后胶回收并纯化目的片断。将目的片断与pMDl8一TVector克隆载体进行连接，转化入DHSo感受态细胞中，对pMDl8T

3、—esp重组质粒进行PCR扩增，单、双酶切，测序鉴定。构建pET28a-esp重组质粒并转化入BL21感受态细胞中。将pET28a—esp／BL21经过IPTG最佳浓度诱导，通过蛋白电泳SOS—PAGE鉴定『F确后，用镍柱纯化，得到纯化的Esp目的蛋白。将制备的粪肠球菌全菌体超声裂解灭活菌苗和Esp目的蛋白分别免疫家兔，获得全菌体和目的蛋白的抗血清，通过Western-Blot方法检测目的蛋白的免疫原性和间接ELISA方法检验目的蛋白的反应原性。结果：1．构建的重组质粒由单、双酶切，PCR扩增和测序鉴定正确后，表明成功的克隆了粪肠球菌es

4、p基因的碱基序列，并且证明克隆片段阅读框架正确，重组质粒的克隆载体构建成功。2．成功构建pET28a—esp／BL21，在pET28a(+)系统中成功表达了Esp融合蛋白，获得小量纯化的Esp重组目的蛋白。经Western—blot及间接ELISA方法，证实了重组蛋白的免疫原性及反应原性。结论：1．实验表明粪肠球菌esp碱基序列克隆成功，该碱基序列长498bp编码166个氨基酸。2．在pET28a系统中成功表达了Esp融合蛋白并小量纯化，为进一步研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定相关的理论基础。关键词：粪肠球菌；Esp基因；克隆；原核表达

5、；间接ELISAEnterococcusFaecalisEspGeneCloning，ProkaryoticExpressionandProteinCharacteristicsPreliminaryResearchAbstractObjectiv：Toconstructprokaryoticexpressionvectorofespgene，expressitinEscherichiacoliBL21，andstudytheimmunocompetenceandapplication．Methods：’GenomicDNAwasextr

6、actedn．omfaecalis，epitopesites，hydrophilicityandantigenicindexparameterswerepredictedbyDNAStarProteanprogramaccordingtotherelevantnucleotidesequencefromGenBank，andapairofspecificprimerswasdesignedtoamplifytheepitopeofespgenebyPCR．Thefragmentwasclonedintothemultiplecloning

7、siteofpET-28(a)，formingtherecombinantprokaryoticexpressionvector(pET28一esp)，TherecombinantplasmidpET28a—espwastransformedintoE．coliBL21bycommonmethodandtheBL21／pET28一espwasinducedbyIsopropyl—P—D-thioglactoside(IPIG)toexpressfusionprotein，optimizetheexpressioncondition．The

8、ntheexpressedproteinsinE．coliBL21wereanalyzedwithSDS—PAGEelectrophoresis．Westernblottingwasperfo