牦牛转铁蛋白基因克隆与原核表达

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1、分类号；密级：少手馨系／＊乂聲；硕：ｔ学位论文题目：轮牛接铁番白某因克倏与原核表达姓名：达小强Ｙ１２２１４０４６９：学号牛俞科挙写工巧学協学院：专业：恃神经巧动物饲养研究方向：特种络巧动娩种庵巧瓶俱护有Ａ子育种杨具旧巧荣惹导师：二〇年月ＣｌｏｎｉｎａｎｄｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｐｙｐｆｒｏｍＹａｋＡＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｔｅｄｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＤａＸｉａｏｑｉａｎｇＳｕｅｒｖｉｓｏｒ；

2、ＹａｎＪｕｔｉａｎＰｒｏｆ．ＺａｎＲｏｎｘｉｎＰｒｏｆ．ｐｇｇｇＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓｙＬａｎｚｈｏｕＣｈｉｎａ，关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的作品，知识产权巧属西北民族大学。本人完全了解西北民族大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部口或化构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权西北民族大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与

3、该论文直接相关的学术论文或成果时一署名单位仍然为西北民族大，第学。保密论文在解密后应遵守此规定。义、论文作者签名；导师签名日期：原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果。除文中己经注明引用的内、数据、观点等，均己明确注明出处容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。一心Ａ论文作者签名－：Ａ日期：立ｊｎｔ一幸妹Ｉ摘要Ｗ成年天祝白

4、巧牛肝脏组织为试验材料，根据巧牛Ｔ違因ＣＤＳ区序列设计引物，利用ＰＣＲ巧逆转录ＰＣＲ技术克隆获得天祝白巧牛转铁蛋白基因编码区序列，并结合生物信息学方法对其遗传特性进行了分析；通过基因工程手段，构建原核重组表达载体，实现了巧牛转铁蛋白在Ｅ．ｃｏＨＢＬ２１ＤＥ３）中的异源表达；采用实（验室３Ｌ发醇罐水平进行发酵小试，为深入研究转铁蛋白结构和功能，实现规模化工业生产提供实践基础和理论指导。研究结果如下：１．克隆获得了大小为２１１５ｂｐ的基因片段（ＧｅｎＢａｎｋ收录号为ＫＰ７２０６２４），Ｔ一为湛因的完整编码区，编码７０４个氨基酸，其Ｎ端有个１９个氨基酸组成的信号肪

5、含两个高度保守的同源结构域，同源性为４２％，Ｔ湛因编码的蛋白分子量７５．大小．７８ＫＤａ，理论等电点为６６３；２．序列分析显示，克蔭获得的Ｔ湛因序列存在４个碱基突变，其中：两个同（４１１１１义突变（５７ａ—Ｇ７５０ｔ—Ｃ），８２ａ？ｔ，５—Ｃ），６、，两个错义突变ｔ引起第—一１７１位氨基酸发生改变ａＧ、ＬＦ）。３．利用ＤＮＡｍａｎ软件进行氨基酸同源性分析，结果表明：天祝白巧牛Ｔ堪因氨基酸序列与致巧牛、牛、水牛、藏終羊、绵羊、野猎、人、鼠、鸡和鱼Ｔ錫基〇％％酸序列间的同源性分别为９９／、、９４％、９３％、７５％、６９％、６４％、：１００％、〇５１％．３９％

6、；４．在不改变氨基酸编码序列前提下，充分考虑并且适当的调整ＧＣ含量，对目的蛋白序列中阻碍蛋白翻译起始的二级结构和存在于目的蛋白序列中的原核宿主菌的稀有密码子进行优化，去除Ｔｆ自身的编码信号肢氨基酸序列。优化后的Ｔ湛因序列ＧＣ含量为５０％，优化了起始密码子附近ｍＲＮＡ的２个小的发夹结构和２个中等大小的发夹结构。通过全基因合成获得目的基因，构建重組子ＧＨ－ＤＴ１２－１９Ｔｆ。ｐ－－５．构建Ｔｆ３０ａＴｆ。．ｃｏｌ３原核表达载体ｐＥＴＷＥｉＢＬ２１（ＤＥ）为宿主菌，ＩＰＴＧ’她为诱导剂（１８Ｃ，ＩＰＴＧ终０．５ｍＭ，１）诱导表达，，筛选出最佳表达条件浓度

7、为－经ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定其分子量约为７６ｋＤａ。进行实验室３Ｌ发酵罐水平高密度发酵，经Ｈ－ｉｓｂｉｎｄ镶柱亲和层析和离子交换层析纯化获得浓度为０．８０ｍｇ／ｍＬ，纯度大于７０％的重组蛋白７．２０ｍｇ。－－关键词：天祝白巧牛，Ｔｆ基因，序列分析，重组子ｐＥＴ３０ａＴｆ，原核化＇表达，ｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇＩＩＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒ