鹅源粪肠球菌毒力因子gele的克隆、原核表达及生物信息学分析

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1、摘要目的：克隆鹅源粪肠球菌毒力因子gelE基因，构建原核表达载体，在BL21中高效表达，并对其进行生物信息学分析。方法：l根据NCBI数据库GenBank中登录号为：D85393．1的粪肠球菌明胶酶基因的碱基序列，利用生物信息学软件PrimerPremier5．0和Oligo6．0设计一对特异性引物；提取鹅源粪肠球菌总DNA，做为扩增模板；PCR扩增，产物凝胶电泳分离后将目的片段回收；将回收片段与pMDl8．T克隆载体连接，转化至DH5a感受态细胞中；筛选阳性克隆菌株，提取重组质粒，进行PCR及单、双酶切鉴定，鉴定正确后送公司测序。2将成功克隆的重组质粒pMDl8．T-gel

2、E进行双酶切，回收目的片段，与原核表达载体pET-28a连接，构建pET-28a-gelE重组质粒，转化入BL21感受态细胞中；筛选pET-28a．gelE／BL21阳性菌株，IPTG诱导表达，SDS．PAGE蛋白电泳鉴定明胶酶蛋白’。3利用生物信息学软件对表达的明胶酶蛋白序列进行组分、分子质量、滴定曲线与等电点等分析，预测其一级结构中糖基化位点等；根据对其可塑性、亲水性、抗原性指数和表面可及性以及D．转角、无规则卷曲等的综合分析，预测潜在抗原表位。结果：成功克隆了鹅源粪肠球菌菌株毒力因子gelE基因，其碱基序列为1770bp，编码590个氨基酸。本试验成功构建了pET-28

3、a-gelE／BL21表达载体，IPTG诱导蛋白表达后用SDS．PAGE方法鉴定，明胶酶蛋白为72KD，与预期一致。鹅源粪肠球菌明胶酶蛋白多位氨基酸的亲水性指数≥0、AI>／0、表面可及性≥1；具有D．折叠和无规则卷曲，是明胶酶蛋白的B细胞潜在抗原表位。结论：成功克隆鹅源粪肠球菌毒力因子gelE基因，成功表达明胶酶蛋白，综合预测了明胶酶蛋白的B细胞潜在抗原表位。关键词：鹅；粪肠球菌；gelE基因；生物信息学分析CloningandProkaryoticExpressionaswellasBioinformaticsAnalysisofvirulencefactorsgelEo

4、fEnterococcusFaecalisfromGooseAbstractObjective：TocloneandconstructtheprokaryoticexpressionvectorofgelEgeneofEnterococcusfaecalisfromgooseandexpressedinE．coliBL21whichistheengineeringbacteria．Bioinformaticsanalysisofgelatinaseprotein．Method：1AccordingtothebasesequenceofgelatinasegeneofEnter

5、ococcusfaecalisinNCBIdatabaseGenBankaccessionnumber：D85393．1，usedPrimerPremier5andOli906softwaretOdesignacoupleofspecificprimers；ToextractthewholeDNAfromtheisolatesofgooseastheamplificationtemolet；PCRamplification，recycledthefragmentafteragarosegelelectrophoresisisolatedtheproduct；Junctedth

6、efragmentandpMD18．TcloningvectorthentransformedintoDH5acompetencecell；Screenedthepositiveclones；ThenextractedtheplasmidDNA，andtherecombinantplasmididentificatedbysingleanddoublerestrictionenzymeandPCR．thensentittothecompanytObesequenced．2RestrictionenzymetherecombinantPMD18-T—gelEplasmidwhi

7、chWasclonedsuccessfully，recycledthefragment，andjunctedthefragmentwithpET28aexpressingvector．constructedthePet-28a-gelErecombinedplasmidandtransformedintoBL21competencecell；ScreenedthepositivestrainsofpET．28a-gelE／BL21whichwassuccessfulcloned，comfirmation