马腺疫链球菌fne基因的克隆及原核表达

《马腺疫链球菌fne基因的克隆及原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：２７－３１ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ马腺疫链球菌ＦＮＥ基因的克隆及原核表达徐全圆，刘建华，苏艳，加尔肯，王世民，冉多良＊（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐８３００５２）摘要：采用ＰＣＲ方法从马腺疫链球菌新疆分离株中扩增ＦＮＥ基因片段，克隆至ｐＭＤ１９－Ｔ载体。利用分子生物学软件分析测序结果，将ＦＮＥ截短基因亚克隆至原核表达载体ｐＥＴ－３０ａ中，转化到大肠埃希菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，以ＩＰＴＧ诱导ＦＮＥ重组蛋白的表达，用ＳＤＳ－ＰＡ

2、ＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法分析蛋白表达及其反应原性。序列分析显示，其与ＧｅｎＢａｎｋ收录的马腺疫链球菌４０４７（登录号ＹＰ００２７４７２１６）核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为９９％。采用ＰＣＲ法扩增到６７５ｂｐ的ＦＮＥ截短基因片段构建重组表达载体获得重组蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析在４６ｋｕ处出现明显条带，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析显示具有反应原性。成功克隆和表达了马腺疫链球菌的ＦＮＥ截短基因，为重组ＦＮＥ蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。关键词：马腺疫链球菌；ＦＮＥ基因；序列分析；原核表达中图分类号：Ｓ８５２．６１１文献标

3、识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００２７－０５马腺疫是由马链球菌马亚种引起动物发热、上白Ｍａｒｋｅｒ购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白呼吸道黏膜发炎、下颌淋巴结肿胀化脓为特征的急预染Ｍａｒｋｅｒ购自天根生物有限公司；ＨＲＰ标记的［１］性接触性传染病，马链球菌马亚种又名马腺疫链兔抗马二抗购自美国ＢＥＴＨＹＬ公司；马腺疫链球［２］菌新疆分离株、原核表达载体ｐＥＴ－３０ａ、一抗为新疆球菌，为链球菌属Ｃ群成员。在侵袭宿主时先是通过纤黏蛋白结合蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）黏附到宿伊犁地区发生马腺疫的阳性马

4、血清由新疆农业大学主细胞上［３］，由于马链球菌表面具有透明质酸荚膜，动物医学学院传染病实验室保存；其他试剂均为国抗吞噬类Ｍ蛋白［４］，与分泌的一些外毒素共同作用产分析纯。来逃避机体的吞噬［５］。纤黏蛋白结合蛋白能够与机１．２方法体内的纤黏蛋白相结合［６］，有助于病原菌在机体内１．２．１引物的设计与合成参考ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的ＦＮＥ的基因序列（ＡＦ３６０３７３），设计一对引物：的侵袭及扩散。现已报道的马腺疫链球菌纤维蛋白［７］ＦＮＥ－Ｌ－１：５′－ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴ－结合蛋白有ＦＮＥ、ＦＮＥＢ和ＳＦ

5、Ｓ３种，其中ＦＮＥ［８－９］ＣＡＴＴＴＡＧＡ－３′；ＦＮＥ－Ｌ－２：５′－ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴ和ＳＦＳ为分泌型蛋白，ＦＮＥＢ为细胞表面锚定型［１０］ＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧ－３′。引物的５′端分蛋白。本研究以马腺疫链球菌新疆株ＦＮＥ基因别添加ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ酶切位点（下划线部分），进行克隆测序分析及原核表达，为重组ＦＮＥ蛋白亚引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，预计单位疫苗的研制奠定基础。扩增片段分别为１８６０ｂｐ。１材料与方法１．２．２ＦＮＥ基因的ＰＣＲ扩增按ＵＮＩＱ－１０柱式１．１材料细菌基因组ＤＮ

6、Ａ抽提试剂盒的说明：离心收集菌Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制液沉淀，加入溶菌酶使细菌裂解，ＢＤｂｕｆｆｅｒ洗去蛋性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ、ｐＭＤ１９－ＴＶｅｃｔｏｒ购自白，ＰＷＳｏｌｕｔｉｏｎ洗涤，向吸附膜中央加入预热的Ｅ－ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、细菌基因组ＤＮＡ抽提ｌｕｔｉｏｎ－ｂｕｆｆｅｒ，静置后离心，所收集的ＤＮＡ溶液于－试剂盒、质粒小提及胶回收试剂盒购自上海生工生２０℃保存备用。以细菌ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩物工程股份有限公司；受体菌ＤＨ５α、受体菌ＢＬ２１增，反应程序为：９５℃５ｍｉ

7、ｎ；９５℃３０ｓ，６２℃３０ｓ，（ＤＥ３）、蛋白纯化ＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏＮｉ－ＮＴＡＲｅｓｉｎ以及蛋７２℃９０ｓ，共３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。收稿日期：２０１４－０４－１５基金项目：国家星火计划项目（２０１１ＧＡ８９０００８）；国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＤ４６Ｂ００）作者简介：徐全圆（１９８９－），男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事动物传染病的诊断与防治研究。＊通讯作者２８动物医学进展２０１４年第３５卷第１２期（总第２５８期）１．２．３ＦＮＥ基因的克隆与鉴定根据ＤＮＡ胶回收试剂盒说明回收ＰＣＲ产物，回收产物经

8、ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切连接到ｐＭＤ１９－Ｔ载体转入ＤＨ５α，涂于含Ａｍｐ抗性的ＬＢ平板上，挑取单个菌落进行ＰＣＲ与酶切鉴定，获得阳性重组质粒ｐＭＤ１９－Ｔ－ＦＮＥ－Ｌ，送与上海生工生物工程股份有限公司测序。１．２．４ＦＮＥ序列的生物信息学分析用Ｂｌａｓｔ和ＤＮＡＳｔａｒ软