马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

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1、甘肃农业大学顿士学位论文摘要摘要【目的】为了解马麝朊蛋白基因结构特征和其细胞型朊蛋白的性质，以填补国内外对马麝朊蛋白基因研究的空白，并为进一步研究马麝朊蛋白结构特征和动物朊病毒病传染的种间屏障机制提供实验材料和理论依据，本研究准备对马麝朊蛋白基因进行克隆及其原核表达。【方法】应用分子克隆和DNA重组技术，以健康成年马麝全血中提取的基因组总DNA为材料，用所设计引物以PCR扩增细胞型朊蛋白基因，并克隆目的DNA片段至IJpMD18．T载体，建立完整朊蛋白基因克隆，测序后以DNAstar软件比较分析其核苷酸和推导氨基酸序列特征及其同源

2、性；以马麝完整朊蛋白基因重组质粒为材料，PCR扩增表达目的基因片段，构建重组表达质粒pGEX．MuPrP(85～233)，转化S．coliBL21(DE3)，进行诱导表达条件优化和重组菌的诱导表达，以SDS．PAGE和Westemblotting鉴定表达产物，从而建立马麝重组朊蛋白(85～233)的原核表达菌GST-MuPrP(85～233)。【结果】序列分析表明，4个马麝朊蛋白基因的完整编码区均为包含在单一外显子内完整开放阅读框，其全长为771bp，含5个短而富含G．c的元件，可编码5个八肽(九肽)重复Pro-His-Gly·G

3、ly-Gly—Trp-Gly-Gin或Pro—Gin／His-Gly—Ala／Gly-Gly—Gly—Trp—Gly-Gin及24个氨基酸的N-端信号肽和23个氨基酸的C．端信号肽。与同科不同亚科的马鹿和白尾鹿以及不同科的奶牛和绵羊朊蛋白基因序列比较，核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性为97．3％～98．2％和97．7％～98．8％，说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的。马麝朊蛋白基因与马鹿和白尾鹿相比，存在G57A、S100N、N173S、T177N和M208I5个异义突变：与绵羊相比，存在G57A、$98T和S100

4、N3个异义突变；与牛相比，除缺失一个八肽重复外，还存在G57A、G100N、S146N、H158Y、E189Q和M208I6个异义突变。G57A突变发生于第一个重复九肽的第4位，该突变在己知人和动物朊蛋白基因中未曾发现，为马麝朊蛋白基因所特有。所构建的马麝重组朊蛋白(85～233)原核表达载体pGEX—MuPrP(85～233)，经转化EcoliBL21(DE3)，成功地获得重组表达菌EcoliGST-MuPrP(85～233)，可表达预期大小约为42．4ku的融合蛋白。在诱导表达优化条件下，该重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30

5、％以上的融合蛋白。免疫印迹检查，融合蛋白GST-MuPrP(85～233)可与抗牛单克隆抗体4C1l反应，各氨基酸突变并不影响单抗4Cll的识别表位。【关键词】马麝；朊蛋白基因：DNA克隆；序列分析；重组朊蛋自；原核细胞表达¨肃农业大学颂士学位论文摘要SummaryobieetiveThisresearchistoobtain研onprotein(PrP)geneDNAcloningandprokaryoticexpressionproteinsofonemuskdeer．Thenthecharacterofgenestructu

6、reandtheproperityofcelluarisoforlTlofmuskdeerPrPcallberealized；theresultwillenricht11eresearchofthePrPgeneaboutruminantintheworld，andbringexperimentalmaterialsfortheresearchofproteinstructureandthemechanismofinterspeciesbarrierforPrPinfection．．MethodsAdoptingthemolecu

7、larcloningandtherecombinantDNAtechnology,usingthetotalDNAswhichwereextractedfromperiphemlwhole·bloodofmuskdeer,thePrPgeneswereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)withapairofprimers，andthenclonedintopMD18-TVector,theentirecloneofPrPgeneWaSconstructed．Aftersequencing

8、，thenucleotideswereanalyzed&theaminoacidsequencesandtheirhomologywerededucedbyDNAstarsoftware；takingtheentirerecombinantPrPg