粪肠球菌tlme3株acea基因的克隆和原核表达及生物信息学分析

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1、分类号——ICS学校代码!Q!圣鱼学号巡!Q墨姜4￡～茎一3复内蒙喜民撤大学硕士学位论文粪肠球菌TLME3株AceA基因的克隆和原核表达及生物信息学分析ClongingandProkaryoticExpressionaswellasBioinformaticsAnalysisofGenefromE．faecalisStrainTLME3申请人：聂鑫学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病的分子流行病学和防制新方法研究学位类别：学术学位指导教师：高原教授论文提交日期：--Oo六年四月摘要IlUlIIII

2、IIIMIIINil111111IY21347291、粪肠球菌是一种新的人畜共患病病原菌，是医院内感染、死亡和羔羊脑炎、鹑鸡败血症等动物疾病的重要致病菌，特别是耐药菌株给防治造成了极大困难。在粪肠球菌感染宿主过程中，是由其Ace介导黏附在宿主细胞上，完成定植和感染第一步的。Ace是一种MSCRAMM，与细胞壁锚定蛋白相似。Ace黏附作用的靶物质是ECM，平时它被上皮细胞等覆盖，宿主组织损坏时暴露，细菌定植在其上而导致感染。Ace晶体结构BI折叠处形成一个明显的凹槽，是与胶原结合的部位。血清和Ⅳ型胶原可

3、使AcernRNA产量显著增加，转录调节因子Ers编码的蛋白是Ace的阻遏蛋白，QS．Fsr系统或GelE表达中断，可显著增强粪肠球菌对胶原蛋白的黏附。2、为了检测粪肠球菌TLME3株是否含有AceA基因，为在原核细胞中表达该基因的AceA蛋白奠定基础，根据NCBI数据库GenBank中登录号为CP002621的粪肠球菌基因917167,--,918123bp处的核苷酸序列，设计～对特异性引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物与pMDl8．T载体连接，转化入DH5a中，PCR检测出阳性克隆，提取质

4、粒做单、双酶切鉴定，对鉴定正确的质粒送生物公司测序。结果PCR扩增产物和重组质粒凝胶电泳条带均在约957bp处；pMDl8．T．AceA重组质粒单酶切凝胶电泳条带约在3649bp处；双酶切凝胶电泳条带共2条，其中2692bp处的为载体条带，957bp处的为目的基因条带。结果表明，本试验成功克隆了粪肠球菌TLME3株AceA蛋白基因。3、为了深入进行粪肠球菌TLME3株AceA蛋白功能研究，检测其免疫活性，探索其作为雏鹅粪肠球菌性败血症疫苗和诊断生物制剂的候选蛋白的可能性，将粪肠球菌TLME3株AceA

5、基因与pET．28a(+)原核表达载体连接，构建重组质粒pET．28a(+)．AceA，转化入大肠杆菌BL2l(DE3)内，经PCR鉴定、BamHI、XhoI酶切鉴定以及测序后，用IPTG诱导表达，对表达的蛋白质进行SDS．PAGE分离。结果PCR产物琼脂糖凝胶电泳中含有约957bp的条带，重组质粒pET．28a(+)．AceA琼脂糖凝胶电泳中含有6326bp的pET一28a(+)．AceA单酶切条带，还有约5369bp的pET．28a(+)载体条带和约957bp的目的条带；SDS．PAGE上含有40

6、．0KD的AceA蛋白质条带。结果显示，本试验在BL21(DE3)中高效表达了粪肠球菌TLME3株AceA蛋白。4、为了对粪肠球菌TLME3株AceA蛋白作进一步的试验研究，给构建雏鹅粪肠球菌性败血症表位疫苗奠定基础，使用NCBI的BLAST、SWISS—MODEL等在线软件和Lasergene7．0等本地软件，对TLME3AceA基因及编码的蛋白质序列进行同源性搜索，做多重比对并生成发育树，预测其变异性；对其蛋白质序列进行组分、分子质量、滴定曲线与等电点等理化特性分析；预测其一级结构中糖基化位点等修

7、饰位点和模序，预测二级结构中的．转角、无规则卷曲等的位置，预测三级结构并分析与其他菌株AceA的同源性；对蛋白质序列进行可塑性、亲水性、抗原性指数和表面可及性综合分析，预测潜在抗原表位；预测mRNA二级结构。结果同源性较高的核苷酸和蛋白质序列分别为59个和88个，同源性分别为97％～100％和96％100％，核苷酸和氨基酸的变异率分别为1．31％和1．63％，与88个蛋白质处于同一分支的2个节点上，与AF260891在同一位点上，与ZP05569670和ZP07552605在一个小分支上，与其余序列也

8、较近；分子质量40．0kD，所含19种氨基酸中Thr最多、Glu和Asn其次，等电点4．32为酸性蛋白；含有N．基糖基化等的修饰位点；与ATCC29200的D．转角和无规则卷曲位置基本相同；与SWISS．MODEL模仿的AceA蛋白三级结构同源性为98．63％；综合预测的潜在抗原表位有270"--284等8处；mRNA二级结构包含多种结构元件。结果显示，TLME3AceA基因高度保守，具备候选表位疫苗或诊断试剂蛋白的条件。关键词：粪肠球菌；AceA基因；