文蛤MmPlg基因和MmCtl基因的克隆、表达及功能研究

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1、文蛤是我国重要的水产养殖品种，但近年来养殖业出现了许多严重制约产业发展的〃瓶颈〃问题，造成了巨大的经济损失。纤溶酶和组织蛋白酶L等在动物的生长发育中具有重要作用。研究和了解文蛤的生长发育过程和调控机理•对文蛤人工育苗和养殖产业的发展具有十分重要理论价值和现实意义。本文以文蛤为研究对象，研究内容主要分为以下5个部分：第1部分：通过RACE技术从文蛤体内克隆到文蛤纤溶酶原MmPIg基因和文蛤组织蛋白酶LMmCtl基因•井对它们的核酸序列和编码的蛋白序列进行了生物信息学分析；结果如下：(1)文蛤MmPIg基因

2、序列全长921bp，包含1个819bp的幵放阅读框，编码的蛋白含272个氨基酸残基，其中前16个为信号肽序列。MmPIg蛋白的理论分于量为28.7kD，等电点为6.42，包含由组氨酸(His77)、大冬氨酸(Asp126)和丝氨酸(Se「220)组成的典型丝氨酸蛋白酶活性位点•序列比对分析发现MmPIg和单环刺蟠(Urechisunicinctus)和栉孔扇贝(Chlamysfarreri)的纤溶酶相似度较高。(2)文蛤MmCtl基因序列全长1304bp，包含1个1005bp的幵放阅读框•推导的蛋白含3

3、34个氨基酸残基，其中前16个为信号肽序列。MmCtl蛋白的理论分于量为37.5kD•理论等电点为5.27.利用ConservedDomainSearCh工具分析MmCtl蛋白序列，结果表明该酶是PeptidaseC1A亚家族成员•含有木瓜蛋白酶特异的活性催化位点和底物结合位点。第2部分：以文蛤-actin基因为内参，利用实时荧光定量PCR技术分析了MmPIg基因和MmCtl基因在文蛤发育不同时期(担轮幼虫、D型幼虫、壳顶幼虫和稚贝)mRNA表达量的变化；利用实时荧光定量PCR技术分析了MmPIg基因和

4、MmCtl基因在文蛤成贝不同组织(肌肉、外套膜、鲤、肠和肝胰腺)中的mRNA表达量变化。结果如下：(1)组织定量结果显示结果显示MmPIg在各个组织中都有表达-而肠的表达量则明显高于其它四个组织，是鲍中表达量的大约2倍；发育定量结果显示在担轮幼虫和D型幼虫时期，MmPIg的表达量变化不明显•到壳顶幼虫时期•MmPIg的表达量大幅度上调•文蛤发育成稚贝后，MmPIg表达量稍有下调，但还是远远高于前两个时期。经分析推测MmPIg可能参与文蛤对营养成分的消化；(2)组织定量结果显示结果显示MmCtl在各个组织

5、中都有表达・肝胰腺的表达量最高；发育定量结果显示，随着文蛤发育MmCtl表达量呈明显上调趋势•从担轮幼虫到D型幼虫MmCtl表达量稍有上升，到壳顶幼虫期表达量大约为担轮幼虫期的20倍，至稚贝期表达量达到最高经分析推测MmCtl可能通过细胞凋亡等机制参与了文蛤幼虫的发育过程。第3部分：构建了文蛤MmPIg基因的原核表达载体，在大肠杆菌DE3宿主菌体内实现了诱导表达，井对表达的蛋白进行了纯化，用纯化后的DsbA-MmPIg融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备了抗血清。结果如下：获得的融合蛋白DsbA-MmPlg的

6、分于量为52.7kD*包涵体表达，用纯化后的融合蛋白制备抗血清，WesternBlot结果表明本实验制备的抗血清具有较好的特异性。第4部分：对文蛤MmCtl基因进行了原核表达，纯化了融合蛋白，井制备了融合蛋白DsbA-MmCtl的抗血清。结果如下：获得的融合蛋白DsbA-MmCtl的分于量为60.5kD，包涵体表达・用纯化的融合蛋白进行抗血清的制备•WesternBlot结果显示该血清具有较好的特异性。尖键词：文蛤；纤溶酶原；组织蛋白酶L;实时荧光定量PCR;原核表达；抗体制备；WesternBlotA

7、bstractMeretrixmeretrixisanimportantaquaCulturespeCiesinourCountry.ButreCentyears,alotof"bottleneck"problemswhiChseverelyrestrictedthedevelopmentoftheaquaCultureappearedandCausedgreateConomiClosses・FibrinolyticenzymeandCathepsinLplayimportantrolesingrowt

8、handdevelopmentofanimals・UnderstandingthegrowthprocessandregulationmeChanismofClamaremeanfulforartificialbreedingandthedevelopmentofaquaCultureintheoryandreality.Inthispaper,weusedMeretrixmeretrixastheresearchobject,theCon