克隆基因表达及基因干扰-修

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克隆基因的表达及基因干扰北京协和医院检验科吴洁1 克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术2 克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术3 第一节外源基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。基因表达4 外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。第一节外源基因的表达克隆基因表达5 第一节外源基因的表达一、原核生物表达体系二、真核生物表达体系酵母，哺乳动物细胞大肠杆菌6 一、原核生物表达体系（二）原核表达载体具有的特点（四）包涵体（一）对外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核细胞中的表达7 （一）对外源目的基因的要求1、不应具有5´端非编码区以及内含子结构2、不能直接用真核基因组DNA.3、常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因.一、原核生物表达体系8 选择标志启动子：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及翻译起始点和终止序列多克隆位点(MCS)（二）原核表达载体具有的特点一、原核生物表达体系原核启动子SD序列MCS终止子9 原核启动子大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列：-35box和-10box（Pribnowbox）TTGACA10 consensussequences11 核糖体结合位点（ribosomebindingsite,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译12 （三）真核生物基因在原核细胞中的表达1.非融合型表达蛋白2.融合型表达蛋白3.分泌型表达蛋白一、原核生物表达体系13 1.非融合型表达蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏（三）真核生物基因在原核细胞中的表达一、原核生物表达体系SD序列ATG-外源基因-TAG14 常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因tac启动子(trp-lac)SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2一、原核生物表达体系15 2.融合型表达蛋白表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。优点：具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。便于融合蛋白的分离和纯化。一、原核生物表达体系16 融合型表达系统主要有GST系统His系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统β-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统一、原核生物表达体系17 ①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST系统----pGEX系列1、载体组成结构:lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP18 GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。GST系统----pGEX系列2、产物提纯:3、产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用＋19 His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（6×His）His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。His系统20 21 3.分泌型表达蛋白载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。一、原核生物表达体系pINIII系列载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点22 （四）包涵体(inclusionbody)一、原核生物表达体系大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。23 （四）包涵体(inclusionbody)1.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性一、原核生物表达体系24 1.包涵体的形成表达产率过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子，中间产物易大量积聚。发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点25 有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。②缺点①优点26 2.包涵体的分离与纯化超声破碎菌体离心包涵体溶解包涵体强蛋白质变性剂：盐酸胍、尿素（5-8mmol/L）3.包涵体的复性逐步降低变性剂浓度，使表达蛋白恢复其天然构型27 （一）酵母表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系二、真核生物表达体系真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因28 （一）酵母表达体系1.酵母表达载体2.酵母表达外源性基因的形式二、真核生物表达体系DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells29 1、酵母表达载体选择性标志大肠杆菌：Ampr、Tetr酵母：Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;复制子启动子上游活性序列转录起始点上游，可促进转录终止序列蛋白结构域如：信号肽序列、核定位序列二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系30 2.酵母表达外源性基因的形式非分泌型分泌型二、真核生物表达体系分泌信号序列31 Leu-酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上或独立在酵母细胞内转化Leu营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化酵母转化和表达的一般过程32 （二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统二、真核生物表达体系33 （二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体(1)原核DNA序列(2)启动子(3)增强子(4)剪接信号(5)遗传标记(6)终止信号和多聚腺苷化的信号二、真核生物表达体系34 细胞系DNA转染方式最初的应用CV-1SV40病毒感染表达野生型、突变蛋白CV-1/293腺病毒感染表达野生型、突变蛋白COS瞬时DEAE-葡聚糖在哺乳类细胞中表达，快速鉴定cDNA克隆，表达突变蛋白。NIH3T3逆转录病毒感染转基因动物、在不同类型细胞中表达鼠成纤维细胞MOP瞬时DEAE-葡聚糖快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋白CHO-DHFR稳定DHFR+转染用氨甲喋呤扩增高效稳定表达灵长/啮齿类痘病毒疫苗神经元细胞EB病毒载体HSV病毒载体克隆表达基因转移2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式二、真核生物表达体系35 3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统（1）COS细胞瞬时表达系统（2）CHO细胞稳定表达系统二、真核生物表达体系36 用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin,SV40）COS细胞37 利用COS细胞表达外源基因38 克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术39 第二节表达产物的分离、纯化与鉴定二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化三、表达产物的鉴定一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化40 一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化1.粗制品的分离纯化2.精制品的分离纯化离心收集菌体超声波破碎离心收集上清热处理变性离心上清用硫酸铵沉淀凝胶层析、离子交换层析41 二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化以α-蛋白酶抑制剂的纯化为例：2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化以酵母表达干扰素纯化为例：收集酵母细胞玻璃珠破碎离心取上清DEAESepharose柱层析梯度洗脱收集活性部分浓缩葡聚糖凝胶G75柱层析收集、浓缩SDS-PAGE纯度鉴定发酵液用0.45µm孔径滤膜过滤浓缩DEAE-Trisacryl柱层析梯度洗脱收集干扰素部分葡聚糖凝胶G75柱层析洗脱收集干扰素稀释层析聚焦缓冲液洗脱电泳鉴定42 三、表达产物的鉴定Western印迹（Westernblotting）1.蛋白质样品的制备2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)3.蛋白质的电转移(胶膜)43 三、表达产物的鉴定44 三、表达产物的鉴定4.靶蛋白的免疫学检测封闭脱脂奶粉或BSA靶蛋白与第一抗体反应与第二抗体反应HRP标记显色45 三、表达产物的鉴定46 第七章克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术47 第三节基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶三、小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)四、微RNA(microRNA)一、反义核酸技术48 一、反义核酸技术（二）反义RNA技术（三）反义核酸技术的应用（一）反义寡核苷酸技术（反义DNA技术）49 （一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制2.反义寡核苷酸的设计与合成3.反义寡核苷酸的修饰4.反义寡核苷酸的给药途径一、反义核酸技术50 （一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达一、反义核酸技术51 2、反义寡核苷酸的设计与合成1）设计①计算机软件预测RNA的二级结构②利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计一、反义核酸技术52 2）合成①长度一般为15～25个核苷酸②G-C含量为60%～65%一、反义核酸技术53 3.反义寡核苷酸的修饰最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰（1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子（2）甲基修饰磷酸骨架（3）聚酰胺键代替磷酸骨架一、反义核酸技术54 4.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径一、反义核酸技术55 （二）反义RNA技术1.反义RNA的作用机制2.反义RNA的设计一、反义核酸技术56 （二）反义RNA技术1.反义RNA的作用机制(1)与引物RNA前体互补结合，抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解一、反义核酸技术57 2.反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单一、反义核酸技术58 （三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：①防止被核酸酶降解②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合④ASON是否会影响正常细胞的基因表达⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题一、反义核酸技术59 二、核酶与脱氧核酶（一）核酶：能够催化RNA剪接的由RNA组成的酶。Cech与Altman分享了1989年诺贝尔化学奖。（二）脱氧核酶：1994年Breaker发现具有催化功能的DNA分子。60 （一）核酶1.核酶的分类2.核酶的结构3.核酶的设计与修饰4.核酶转移方法5.核酶的应用二、核酶与脱氧核酶61 （一）核酶1.核酶的分类（1）大分子核酶：第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P（2）小分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和neurosporaVarkudsatellite核酶二、核酶与脱氧核酶62 2.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心二、核酶与脱氧核酶H：除G以外的任一核苷酸不可逆的自切割反应63 （2）发夹形核酶：二级结构分成两个结构域，每个结构域由螺旋-环-螺旋组成二、核酶与脱氧核酶可逆的自切割反应BN﹡GUCB：除A以外的任一核苷酸N：任意核苷酸64 二、核酶与脱氧核酶3.核酶的设计与修饰设计三要素：高效、特异、稳定两方面：核酶核心与结合臂的设计在底物RNA中选择最佳剪切位点化学修饰主要是对核酶的磷酸二酯骨架的修饰、戊糖环的修饰和碱基的修饰。65 二、核酶与脱氧核酶外源性转移物理方法：裸露DNA直接注射、电脉冲介导、显微注射微粒轰击等。化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、脂质体等。内源性转移病毒载体（逆转录病毒或腺病毒载体）4.核酶转移方法66 二、核酶与脱氧核酶5.核酶的应用已利用组合筛选法得到抑制乙肝病毒复制的发夹核酶、抑制丙肝病毒复制的锤头核酶、能在体外抑制艾滋病毒复制的核酶。为将核酶作为基因工程药物的开发奠定了基础。67 （二）脱氧核酶1.脱氧核酶的结构种类及特征2.脱氧核酶的催化特性3.设计合成脱氧核酶的原则4.脱氧核酶的应用二、核酶与脱氧核酶68 （二）脱氧核酶1.脱氧核酶的结构种类及特征（1）10-23型脱氧核酶：二、核酶与脱氧核酶嘌呤-嘧啶连接处69 （2）8-17型脱氧核酶：二、核酶与脱氧核酶70 2.脱氧核酶的催化特性（1）RNA切割活性（2）DNA连接酶活性（3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性（4）DNA切割活性（5）N-糖基化酶活性（6）DNA激酶活性（7）DNA戴帽活性二、核酶与脱氧核酶71 3.设计合成脱氧核酶的原则（1）总核苷酸数不超过50（2）催化效率不低于核酶（3）具有广泛的RNA切割功能（4）能通过碱基配对与底物结合（5）具有可重复性二、核酶与脱氧核酶72 4.脱氧核酶的应用为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径二、核酶与脱氧核酶73 三、小干扰RNA(siRNA)（二）RNAi的作用机制（三）siRNA的设计原则（四）siRNA的制备方法（六）RNAi沉默效果的检测（一）一般研究路线（七）RNAi的应用（五）siRNA的导入74 （一）一般研究路线三、小干扰RNA75 （二）RNAi的作用机制1.起始阶段2.效应阶段3.倍增阶段三、小干扰RNA76 三、小干扰RNA77 （三）siRNA的设计原则1.siRNA中G+C碱基含量30%-70%，50%沉默效应较高。2.siRNA作用位点避免起始密码下游50-100碱基处、终止密码上游100bp处及5’端非编码区。3.siRNA序列避免连续4个以上A及3个G/C，须经BLAST(hppt://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对。三、小干扰RNA78 （三）siRNA的设计原则4.siRNA碱基数选择以A或G开始的21-23bp的目的mRNA。5.环碱基数一般为9个碱基，TTCAAGAGA6.对照系统将已设计siRNA碱基序列随机排列，且与其他基因无同源性。三、小干扰RNA79 （四）siRNA的制备方法1.化学合成法2.体外转录法3.RNaseⅢ消化法4.siRNA表达载体法5.siRNA表达框架法三、小干扰RNA80 三、小干扰RNA81小发夹RNA(SmallhairpinRNA,shRNA) siRNA的合成方式及特点化学合成法体外转录法RNaseⅢ消化法siRNA表达载体法siRNA表达框架法核酸特征21～23nt双链RNA29nt双链DNAT7启动子后200～800bp的转录模板55～60bp双链DNA≤50bp双链DNA制备时间4天制备DNA双链后24小时制备转录模板后24小时制备双链DNA后5天制备DNA后约6小时转染时间短中等中等长中等测序需要需要不必需要需要标志可以可以可以不可不可转染难易程度容易容易容易非常容易非常容易大规模制备可以有限有限可以有限抗性筛选不可不可不可可以不可抑制作用时间短短短长短费用较高中等较低中等中等三、小干扰RNA （五）siRNA的导入1.脂质体或电穿孔2.病毒携带3.细胞穿透肽三、小干扰RNA83 （六）RNAi沉默效果的检测mRNA水平RT-PCR、realtimeRT-PCR、Northernblotting蛋白质水平Westernblotting、ELISA、免疫荧光、流式细胞三、小干扰RNA84 KumarPPetalNCB,2007RT-PCR85 stable14-foldCD8knockdownbylentivirussiRNAsRubinsonetalNatureGenetics,2003Westernblotting86 （七）RNAi的应用1.基因功能的研究2.基因剔除3.基因治疗4.细胞信号传导途径分析5.药物开发三、小干扰RNA87 BreakthroughoftheYearmiRNA----2002四、微RNA(microRNA)88 MicroRNAs(miRNAs)是一种进化上保守，长21－23nt，非编码的单链小RNA分子。EvavanRooijCirc.Res.2011;108;219-234四、微RNA(microRNA)89 mRNAmiRNANotranslation四、微RNA(microRNA)MicroRNAs在翻译水平调控基因的表达，绝大多数蛋白编码基因(人类约1/3的mRNA)受其调控。90 四、微RNA(microRNA)（二）miRNA的作用机制（三）siRNA与microRNA的区别（四）miRNA的生物学功能（一）miRNA的命名91 miR-#（#代表数字）表示miRNAmir-#（#代表数字）表示相应的编码基因（一）miRNA的命名四、微RNA92 miRBaseHumanmiRNAs(Jan17,2011)http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=hsa93 （二）miRNA的作用机制1.起始阶段2.成熟阶段3.功能阶段四、微RNA94 （三）siRNA与microRNA的区别共同点①由22个左右的核苷酸组成②是Dicer酶的产物③需Argonate家族蛋白的存在④与RISC形成复合物起干扰、调节作用⑤可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA四、微RNA95 siRNA与microRNA的不同siRNAmicroRNA外源性内源性由长dsRNA经Dicer酶切割得到由pre-miRNA经Dicer酶切割而来双链单链与靶mRNA完全互补配对与靶mRNA并不完全互补AGO2蛋白AGO1蛋白降解mRNA而抑制蛋白质翻译阻止mRNA的翻译而不降解靶mRNA抑制转座子活性和病毒感染还可作为合成蛋白质的模板；表达具有时序性、保守性和组织特异性四、微RNA 97 （四）miRNA的生物学功能miRNA与生物体的阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平被抑制四、微RNA98 99 Thanks！100