文蛤snp位点的开发和酪氨酸酶基因的克隆及表达分析

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1、浙江万里学院硕士专业学位论文题目:文蛤SNP位点的开发和酪氨酸酶基因的克隆及表达分析Title:ThedevelopmentofSNPandthecloneandexpressionanlysisoftyrosinasegeneinhardclamMeretrixmeretrix研究生姓名：井岩校内导师：林志华研究员校外导师：沈庞幼高级工程师专业学位类别：工程硕士专业学位领域：生物工程所在学院：生物与环境学院论文提交日期2015年12月31日中图分类号：S968.31单位代码：10876学号：2013881002密级：

2、公开浙江万里学院硕士专业学位论文题目:文蛤SNP位点的开发和酪氨酸酶基因的克隆及表达分析Title:ThedevelopmentofSNPandthecloneandexpressionanlysisoftyrosinasegeneinhardclamMeretrixmeretrix研究生姓名：井岩校内导师：林志华研究员校外导师：沈庞幼高级工程师专业学位类别：工程硕士专业学位领域：生物工程所在学院：生物与环境学院论文提交日期2015年12月31日文蛤SNP位点的开发和酪氨酸酶基因的克隆及表达分析论文作者签名:指导教师签

3、名:答辩委员会主席：上海交通大学委员1：宁波市海洋与渔业研究院委员2：浙江万里学院委员3：浙江万里学院委员4：浙江万里学院答辩日期：2015年12月24日浙江万里学院硕士专业学位论文摘要摘要文蛤（MeretrixmeretrixLinnaeus），是我国主要养殖贝类之一，因其肉质鲜美，营养丰富，素有“天下第一鲜”之称，深受沿海居民喜爱，是出口的主要海产品之一。本文利用文蛤的转录组文库，开发了166个EST-SNP位点，为文蛤的遗传多样性研究和遗传育种提供了可利用的分子标记资源；还克隆了文蛤黑色素合成相关的酪氨酸酶的基因

4、并对其表达量进行了分析，为文蛤壳色的研究提供了参考。1、基于转录组的166个文蛤多态性EST-SNP标记的开发文蛤的转录组测序得到164789个转录本，经过拼接后共获得94525个unigene序列，通过变异检测软件进行SNPCalling，共获得416989个EST-SNP候选位点。依据引物设计原则，随机选取候选的SNP位点设计了445对引物。其中238对引物在文蛤基因组中获得单一的目的扩增条带，在文蛤群体验证分型中191对引物获得准确分型，166个位点为多态性位点。观测杂合度和期望杂合度分别为0.0000到0.76

5、67和0.1831到0.5085，最小等位基因频率从0.1000到0.5000变化。其中76个SNP位点显著地偏离哈温-伯格平衡(P<0.05)。本研究为文蛤的遗传多样性研究和分子标记辅助育种提供了可利用的分子标记资源。2、文蛤酪氨酸酶基因cDNA全长的克隆及分析酪氨酸酶(TYR)是动物黑色素生物合成过程的重要酶，在贝类壳色的形成中起着重要的作用。利用RACE技术对从文蛤转录组文库中检索到的TYR基因cDNA片段进行扩增，经过对测序结果的拼接得到了长为2406bp的TYR基因cDNA全长序列，ORF分析表明TYR包括4

6、2bp的5'-非编码区(5'-UTR)，2067bp的开放阅读框(ORF)，297bp的3'-非编码区(3'-UTR)，3'-序列在距离加尾信号AATAAA140bp处发现了polyA尾巴。经生物信息软件的分析表明，TYR可编码689个氨基酸，分子量为78.25kDa，理论等电点为6.69，存在信号肽序列，无跨膜区域。用普通PCR方法对已经克隆得到的TYR基因的内含子进行克隆，测序后得到3个内含子，大小分别为807bp、754bp和328bp，均属于GT-AG内含子。利用荧光定量PCR对文蛤4中壳色中TYR基因的表达差

7、异性分析显示，TYR在黑壳中表达量最高，且与白壳，粉壳和红壳中的表达量有极显著差异(P<0.01)。关键词：文蛤；EST-SNP；HRM；酪氨酸酶；基因克隆I浙江万里学院硕士专业学位论文ABSTRACTABSTRACTThehardclam,MeretrixmeretrixLinnaeus,isoneofthemajorediblefarmingshellfish.Itisoneofthemainseaoutletproductsknownas“Themostdeliciousdishintheworld”becaus

8、eofitsdelicatemeatandnutritionnourishingandislovedbythepeopleathomeandabroad.Inthispaper,wedeveloped166EST-SNPlocibasedonM.meretrixtranscriptomesequencing,whichprovid