哈维弧菌vh-taa基因克隆表达分析和粘附活性地研究

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2、以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文哈维弧菌Vh-TAA的基因克隆表达分析和粘附活性研究摘要哈维弧菌（Vibrioharveyi）属于革兰氏阴性菌，广泛存在于海水环境中，是海水养殖动物的一种常见致病菌，可引起多种海水养殖动物发病，且死亡率高、影响范围广，给水产养殖业造成了极大的经济损失。病原菌的致病过程中粘附是引发宿主感染的第一步，而粘附

3、素作为病原菌一个重要毒力因子在细菌的粘附过程中起着重要的作用。随着对病原菌致病机理研究的不断深入，人们在革兰阴性菌中发现了一类新的粘附素—三聚体自转运粘附素（TrimericAutotransporterAdhesions，TAA），这类广泛存在于变形菌门，它们在氨基序列和序列大小上存在高度的差异，但是确具有相似的结构特征：即包含N末端信号肽、中间的承载结构域和C末端的转运单位，其中他们的C末端的转运单位在所有的TAA中是同源的，并成为定义TAA的一个标志性区域。TAA作为革兰氏阴性菌与宿主细胞相互作用的重要毒力因子，已成为当前研究病原菌致

4、病机制的热点。目前在哈维弧菌中还未见有关TAA的报道，我们通过同源比对后采用基因步移的方法成功获得了哈维弧菌的一个636bp的开放阅读框（ORF），该ORF编码212个氨基酸，经SMART软件分析发现该氨基序列具有显著的TAA的结构特征，采用信号肽序列分析软件分析发现该氨基序列包含一个1-22aa的信号肽序列，对其预测的同源的C末端的转运区域进行二级机构比对分析，发现它们都包含4个β折叠和一个与其相连的Coiledcoil片段，最后经daTAA验证分析，证实获得的序列为哈维弧菌的一个三聚体自转运黏附素Vh-TAA。为了研究该蛋白的生物学功能

5、，通过分析对预测的承载结构区域进行了原核表达，因为承载结构区域是TAA的功能区域。我们成功构建了重组表达质粒pRSETA-vhp，将该质粒转入表达菌株BL21(DE3)plysS，经IPTG28°C诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳分析，获得了一个22KDa可溶性重组蛋白，经WesternBlot检验，证实获得的重组蛋白为我们所需蛋白。采用Ni-琼脂糖凝胶纯化获得了重组蛋白，并免疫小鼠，成功制备了重组蛋白的多克隆抗体，间接ELISA测定抗体效价为1:16000。最后应用免疫荧光双标记技术，对重组蛋白进行粘附活性实验，激I上海海洋大学硕士学位

6、论文光共聚焦扫描电镜观察，结果显示重组蛋白可以粘附于鲤鱼上皮细胞；重组蛋白及其抗体的粘附抑制试验分别可以显著抑制哈维弧菌对鲤鱼上皮细胞的粘附作用。最终得出哈维弧菌的Vh-TAA具有细胞粘附活性。为进一步研究环境因子对哈维弧菌vh-taa基因表达的影响，利用哈维弧菌vh-taa基因设计了一对特异性引物，扩增产物为194bp的片段，以16srDNA的片段作为内参，利用荧光定量PCR来检测了温度、盐度和铁离子浓度变化对vh-taa基因表达的影响。采用双标准曲线相对定量法对获得的数据进行处理分析，结果发现温度变化对vh-taa基因的表达量影响差异不

7、显著（P﹥0.05）；盐度的影响差异显著(P﹤0.05)，在Nacl浓度为40‰时vh-taa表达量最高；铁离子浓度的影响差异显著(P﹤0.05)，在铁离子浓度为1umol/L时vh-taa表达量最高。为快速的诊断哈维弧菌，采用环介导等温扩增技术（LAMP）成功构建了一种哈维弧菌的检测方法。根据哈维弧菌的rpoA基因序列设计4条引物（内引物F3和B3，外引物FIP和BIP），并对LAMP扩增反应的各物质浓度和反应条件进行优化，确定最佳反应温度为65°C，最佳反应时间为55min。该法对哈维弧菌纯菌2培养物的检测浓度约为2.4×10cfu/m

8、L，且操作简单，反应后体系变浑浊，肉眼可辨；加入SRYBGold荧光染料，阳性反应为绿色，阴性对照为浅橘色，更便于观察，有望发展成为快速检测哈维弧菌的一种有效方法。关键词：哈维弧