衡阳地区镰形扇头蜱分布和带菌情况调查

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独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中持别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：。年月良导‘Ｖ／如外却关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：学校有权保留送交论文的复印件和电子档，允许论文被查阅和借阅，可ｙ？采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，并同意将由此产生的收益捐赠给学校教育基金会用于发展研究生教育。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名；时陆年月。抑起ｏＭ／川＊２＾导师签名：时间：年月，曰占／ｉ了 摘要摘要本研究形态学方法和分子生物学方法对采自湖南省衡阳地区山羊体表的蜡虫进行了鉴定ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术；采用对嫌形扇头婢雌成婢携带细菌情况进行了分析，结果如下；１．体视显微镜观察显示：采自湖南省衡阳地区山羊体表的婢虫假头基六角形、具眼。与文献记述的鎌形扇头碑形态结构、肛后沟；雄成婢侧肛板成嫌刀形一致特点。２－１－．扩増Ｓ和Ｃｏｘ１、克隆、测定了采自湖南省衡阳地区山羊体表婢虫的口；ｅｎＢａｎｋ－与Ｇ库中的序列比对显示：衡阳地区采集的婢虫的口Ｓ１与ＤＱ８３９５５２２（嫌－形扇头婢）同源性是１００％Ｃｏｘ１ｅｎＢａｎｋ７３７０化（镶形扇头婢）同；其与Ｇ中ＪＱ源性为９９．３％。３．通过ＤＧＧＥ分析嫌形扇头婢携带细菌，９条明显条带的序列分别与柯克斯氏体属（ＣｏｘｉｅＪＪａｓｐ．）、假单胞菌属（化ｅｕｄｏｆｌｏｎａｓｓｐ．）芽抱杆菌属化ａｃｉＪＪｕｓ’（ｔｌｏｃｊＶｔ．）、葡萄球菌属ＳａｐｈｙｏｃｃｕｓＳ９．）、ｅｓｅｒｅｎｋｏｍａ、邓Ｊ涅斯捷连科氏菌属（）共生菌（Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）和未培１６ＳｒＤＮＡＶ养王壤细菌的３区序列高度相似。分离到２株细菌，为模仿葡萄球菌和蜡样芽抱杆菌。形态－１ｏｘ－１ＤＧＧＥ关键词：蜡；ＩＴＳＣ列分析；；；序；Ｉ 湖南农业大学硕±学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＩ打ｔｈｉｓｓｔｕｄｔｈｅｔｉｃｋｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｏａｔｓｉｎｈｕｎａｎｈｅ打ａｎｒｅｉｏ打ａｒｅｙ，ｇｇｙｇｇｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｏｒｈｏｌｏｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｂａｃ１；ｅｒｉａｃａｒｒｉｅｄｐｇｇ－ｂｔｈｅｆｅｍａｌｅａｄｕｌｔｔｉｃｋｉｓａ打ａｌｚｅｄｗｉｔｈＰＣ民ＤＧＧＥｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｙｙ，１Ｔｈｔｔｔｔｓ．ｅｉｃｋｓｃｏｌｌｅｃｅｄｆｒｏｍｈｅｇｏａｉ打ｈｕｎａｎｈｅ打ｇｙａｎｇｒｅｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｇｔ－ｍｌｔｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｒｅｏｉｃｒｏｓｃｏｅｉｔｓｃｈｉｅｆｍｏｒｈｏｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉｃｓａｒｅ：ｔｈｅｂａｓｉｓｐ，ｐｇｙｃａｉｔｕｌｉｉｓｈｅｘａｏｎａｌ化ｅａｎａｌｒｏｏｖｅｉｓｂｅｈｉｎｄｔｈｅａｎｕｓＥｅｓｉｓｒｅｓｅｎｔｈｅｓｈａｅｐｇ，ｇ，ｙｐ，ｐｏｆｔｔ．ｈｅａｒａｒｏｃｉｎｍａｌｅｓｉｓｆａｌｃｉｆｏｒｍｐｐ２－－．Ａｆｔｅｒａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｃｌｏ打ｉ打ａｎｄｓｅｕｅｎｃｉ打ｔｈｅＩＴＳ１ａｎｄＣｏｘ１ｓｅｕｅｎｃｅｓｐ，，ｇｑｇｑｏｆｔｈｅｔｉｃｋｆｒｏｍｔｈｅｇｏａｔｉｎｈｕｎａｎｈｅｎｇｙａｎｇａｒｅａａｒｅｖｅｒｉ打ｅｄ；ｔｈｅａｌｉｇｎｍｅ打ｔｗｉｔｈｕｅｎｃｅｔ－ｔｈｅｓｅｑｉｎｔｈｅＧｅ打良ａｎｋｄａａｂａｓｅｓｈｏｗ：ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＩＴＳ１ａｎｄ－Ｄ８３９５５２２ｉｓ１００％ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＣｏｘ１ａｎｄＪ７３７０８５ｉｓ９９．．３％Ｑ，ｇｙＱ３．ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｃａｒｒｉｅｄｂｙＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓａｒｅａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈＰＣ民－ｕｅｎｃｅｓＤＧＧＥ化ｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗ化ａｔ化ｅｓｅｉｎｎｉｎｅｃｌｅａｒｌｓｔｒｉｅ，ｑｙｐｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌａｒｅｒｅ．ｌａｔｅｄｔｏＣｏｘｉｅｌｌａＣｏｘｉｅｌｌａｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｎｕｓｓｅｕｓｐｙｐ，ｇＰｄｏｍｏｎａ｛ｓｐ．）Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｅｎｅｒａ｛Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）＾Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．，？別足ｏｍ幻，Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｂａｄｅｒｉａａｎｄｔｈｅｓｏｉｌｂａｃ化ｄａｌ．２ｓｔｒａｉｎｓｂａｄｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｉｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒａｒｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｉｍｕｌａｎｓａｎｄｂａｃｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ．－Ｋｅｒｄｓ－ｗｏ：ＲｈｉｉｃｅｈａｌｕｓｈａｅｍａｈｓａｏｉｄｅｓＩＴ１ｏｘ１ＤＧＧＥｐｐｐｙｌＳ；Ｃ；ｙ；ＩＩ 目录目录一第章文献综述１１．１婢虫的形态学鉴定及其相关方法２１．２婢虫的分子生物学鉴定方法３１．２３．１核酸序列分析技术第二章婢的形态学和分子生物学鉴定６２６．１材料与方法２．１．１材料６２．１．２方法７２．２结果与分析１１２．２．１待检婢的形态结构１１２－－．２．２待检婢ＩＴＳ１和Ｃｏｘ１克隆、测序１５２．２．３衡阳地区嫌形扇头婢的分布２０２．３讨论２２第Ｈ章嫌形扇头婢带菌情况分析２４３２４．１材料与方法３．１．１材料２４３．２２日．１方法３．２结果分析２７３．２．１细菌１６ＳｒＤＮＡＶｓ区扩增２７ＩＩＩ 湖南农业大学硕±学位论文３．２．２ＤＧＧＥ检测结果２８３．２．３优势条带的测序和比对结果２９３．２．４细菌的分离鉴定２９３．３讨论３０结论３２参考文献３３致谢３９作者简介４０ＩＶ 第一章文献综述第一章文献综述ＩＷ婢又名扁或，属节肢动物口、蛛形纲、婢蝴亚纲、婢、草爬子、狗豆子Ｗ一一。蝴目，是类Ｗ吸血为生的体外寄生虫婢类个生命周期包括卵、幼婢、一若碑和成婢四个阶段，除卵其外，其他各阶段的进步发育均需吸化、获取营养。一Ｗ１９世纪之前，学术界对魄系统分类意见不太致，１９５２年，Ｂａｋａｒ和Ｗｈ一ａｒｒｏｎ将婢类提升为婢峨目中的个亚目（Ｉｘｏｄｋｉｅｓ），根据成虫躯体背面有无Ｗｌ壳质化盾板，婢类分为软蜡科和硬婢科。２００９年，Ｋｒａｎｔｚ和Ｗａｔｅｒ发表的《Ａ７ｔｌｏｆＡｃａｒｏｏ。，Ｍａｎｕａｌｌｇｙ》将婢定为婢蜡总目婢婢亚目Ｗ下的分类阶兀学者基一本同意设立个婢总科Ｉｘｏｄｏｉｄｅａ，下分硬碑科Ｉｘｏｄｉｄａｅ，软婢科Ａｒｇａｓｉｄａｅ及纳Ｗ婢科Ｎｕｔｔａｌｌｉｅｌｌｉｄａｅ等３个科。在软婢科和纳婢科下分属，但硬婢科下又设亚一科阶元。硬婢总科Ｗ下的分类系统，学术界至今没有统定论，但对主要各属的分类意见渐趋一致。Ｍ已知全球有魄计８９９多种，且硬蜡占最大多数。硬婢科包括１２属共约Ｗ一ｔ７００种软婢科包括４属共约１００种纳婢科种类最少，属；；目前只记录了一ｔＷ种，，，。我国幅员迁阔，自然条件复杂种类较多解放前共记录婢类４１种但实际只有３１种，而且有的种是否分布在我国尚为未知。解放后婢类调查工作１２［］２６亚１０成绩显著，现己确定９，，：我国有蜡共１１种分属于科科属其中血ｕ一ｔｉ，约２５种，牛婢属种最少，只有种婢属种类最多。ｔＷ软碑属多寄生于鸟巢和人类房屋的缝、野生动物的生活的巢穴中；硬峭大多寄生在类似于荒原、草场、热带雨林Ｗ及灌木化林的开阔自然界环境ｔＷ自然界中，能捕食婢类的动物很多，例如：家禽、嘶踢或蜘蛛。魄对人类和动物既有直接危害，也有产生间接危害，。两种危害相比间接危害一￣■传播多种人和动物传染病的危害更大婢类叮咬宿主、吸取血液将致宿主贫血，可引起动物、痒痛、消瘦、麻蒋和皮炎等直接危害数量巨大时；一动物死亡无论是宿主婢还是多宿主魄，不同阶段都会更换宿主，这很容ｔＷ易造成人畜共患病在宿主间扩散，因为它们是自然界中第二大可携带病原微ＰＷ生物的传染媒介，能携带包括病毒、螺旋体、立克次体、细菌和原虫等病原１ 湖南农业大学硕±学位论文，传播着森林脑炎微生物。我国分布有Ｈ十种具有公共卫生意义的啤、新疆出血热、脾媒回归热、莱姆病、Ｑ热、北亚蛛传立克次体病、细菌性疾病、无形体病、红肉过敏症、己贝西虫病、泰勒虫病和边虫病等人、兽疾病，造成损失１Ｐ１难预算。１９９５年联合国粮农调查显示世界上有４／５的牛被牌侵袭过，给裔牧业每年造成的损失大约７０亿美金近年，蜡类在我国危害有加大的趋势，ｓｔｔ尤其是发热血小板减少综合征（ＳＦＴＳ，ｅｖｅｒｆｅｖｅｒｗｈｈｈｒｏｍｂｏｃｙｏｐｅｎｉａｓｎｄｒｏｍｅ）在很多地区造成了恐慌，据国家疫病检测报告显示２０１２年１月至ｙ，２０１２ＦＴＳ病１２１１３年月，在河南信阳Ｓ例２５例，死亡８例。江苏省、湖北省、ｐｓｉ迂宁省、安徽省、山东省、云南省等地也时有发生。婢类成虫在不同动物体表的聚集部位不同，例如：在水牛，主要寄生在水牛的耳壳内缘，少量见于颈部、脸部、阴囊基部、耳壳外颈、尾根或者股内侧腹下出等处在黄牛，主要寄生于其腹下、股内侧、颈部、耳廓处；在犬，７Ｐ＇主要发现于头部和耳壳内部在猪和山羊主要寄生于耳壳。；８－２９Ｐｌ镶形扇头婢是南亚地区的常见婢种，从文献看中国西藏、贵州、河北、河南、江苏、安徽、江西、湖北、广东、广西、福建、云南等省、迂宁、浙江ＰＷ都有鎌形扇头魄分布，台湾地区也有发现。但迄今尚无湖南地区存在嫌形扇头婢的记录和报道，本人在长沙地区的犬体表和衡阳地区的山羊体表发现了、经鉴定为鎌形扇头碑。ＰＵ鎌形扇头蜡侵袭的对象有哺乳动物、鸟类、爬行类和两栖类等多类动物，可传播双芽己贝斯虫病、环形泰勒虫病和边虫病等我国对婢类鉴定研究比较薄弱尤其最近３０年几乎处于停滞状态，对记ＰＷ一录的婢种分子标记序列更少，送情况严重制约着婢分子生物学鉴定的发展。本研究将形态学鉴定和分子生物学鉴定结果相互论证，使得银形扇头婢的鉴定结果更为可靠。１１．婢虫的形态学鉴定及其相关方法１国内对嫌形扇头婢鉴定研究比较薄弱，可鉴资料较少：９７８年版科学出版社出版的《中国经济昆虫志》第３５册对嫌形扇头魄的绘图不甚精确，且只画出ＳＰ１鎌形扇头婢部分器官的特征，这不利于我们准确的去鉴定鎌形扇头婢。福建林开铅等发表的《福建省鎌形扇头婢的扫描电镜观察》中利用电子显微镜把嫌形扇头婢的化区小孔数、气口板杯状突数、哈氏器囊孔裂隙等进行了细致的观察，２ 第一章文献综述让人们更直观的了解了嫌形扇头婢的细致结构，但是婢类鉴定资料并非基于超微结构，且很多实验室条件有限，不具备电子显微镜，故其参考意义不大体视显微镜及照相系统是在普通解剖镜基础上加配配高分辨率的摄像头而成，可Ｗ对蜡虫进行显微放大观察、照相体视显微镜观察蜡经济、实用，相片比插图更直观、准确。１．２魄虫的分子生物学鉴定方法１１．２．核酸序列分析技术１．２丄１核糖体ｒＤＮＡ内转录间隔区基因ＰＳＤＮＡ内１核糖体ｒ转录间隔区基因，其具有足够的遗传信息优势、序列长度适中、两端的序列保守、设计引物扩增方便、进化速度快、种间变异大而种内ｐｇｉ变异小、多拷贝髙度相似等优势。所Ｗ，核糖体内转录基因序列被广泛的用。－１于婢种间分类研究通过测序，Ｌ．Ｃｈ扣ｍｉａ等人发现硬蜗种内序列差异在０．５％２－２５－－－（ＩＴ１２之间，种间差异在．２％之间Ｓ与ＩＴＳ结果分别是３．８２１．９％和４０［］２－２５－－．２％）ＤｔＩ１ＩＴＳ．０。．ｍａｒｇｉｎａｕｓ等人对四个不同地理种群间ＴＳ、２序列差异［＂］－－．７１０１．．ｍａｒｒｅｍ等人来鉴别热带区１分别为０．４％、．９２％。Ｍ．ｔ５个花蜡种选用４２］［－－－的是ＩＴＳ２序列。１５种热带区花婢的ＩＴＳ２序列长度都在９５６１２０７ｂｐ之间，１－－．５２８ＩＴ种间差异在．８％之间。张艳艳等人分析四种璃眼蜡利用Ｓ２序列，其中盾糖璃眼婢和残缘璃眼婢，亚东璃眼婢和亚洲璃眼婢指名亚种处在两个分支上，Ｗ其同源性达到９９％。１．２丄２线粒体瓜ＮＡ与ｒＲＮＡ编码２个ｒＲＮＡ与ｒＤＮＡ均存在于线粒体ＤＮＡ中，种间关系和发生学方面的分析主要使用ｒＤＮＡ中的１２Ｓ、１６Ｓ片段１２ＳｒＤＮＡ片段被Ｈｕｍａｉｒ等人４７ｔｌ用之鉴定镜子硬婢种间的亲缘关系。吕继洲等经过测序比对，发现亚洲璃眼婢１６ＳｒＲＮＡｅｎＢａｎｋ１６ＳｒＲＮＡ、小亚璃眼婢样本序列与Ｇ中已知相应婢虫序列４８ＲＮＡ［１聚类，和残缘璃眼蜡之间基于１６Ｓｒ序列的Ｋ２Ｐ遗传距离均为８％左右。Ｂｅａｔｉ等用１２ｓｒＤＮＡ序列结合６３种形态特点来分析属于７个属的３６种硬婢，测定扇头碑属各种和扇头蜡与牛婢属之间的系统关系。高东亚等人使用１２ｓｒＤＮＡ、１６ｓｒＤＮＡ等片段准确地鉴定了铃头血婢和褐黄血婢这两种形态学特征非常相近的碑种，，送两种婢进行同源性分析显示铃头血婢和褐黄血婢同源性分别为ｔＷ９０．４％、９０．８％，这充分显示了此技术的实用性。为了鉴定在河南、湖北两地３ 湖南农业大学硕±学位论文收集的婢，覃新程等人将１２ＳｒＤＮＡ片段和形态学相结合，其分子生物学鉴定结ｓ一ｔｗ果与形态学鉴定结果致，与微小扇头婢和长角血牌聚类。１２．丄３细胞色素氧化酶基因技术在研究鉴定亲缘关系较近的婢种，因为细胞色素氧化酶基因进化速度快，所５－３１５［ｏ－－－Ｗ常将细胞色素氧化酶基因（ＣＩ、ＣｏＩＩ、Ｃｏ曲）与其他基因相结合１为了区别昆±竺全环硬婢的地理种型－Ｉ，Ｓｉｍｏｎ等人通过分析硬婢种内Ｃｏ的差ＳＷｆ－异，最终发现硬牌种内Ｃｏ１差异性小于化８６％。为了比较长角血魄与嗜群血婢是血婢属中亲缘关系较近的２个有效种，支持传统形态学的分类地位，古小彬ｏ－－－－等人比较其ＣＩ和ＣｏＩＩ基因序列，长角血婢与嗜群血蜗ＣｏＩ和ＣｏＩＩ基因序口５］列相似性分别为８９．０％和８８。．４％１２．丄４变性梯度凝胶电泳ＤＧＧＥ变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）创立于ｐｅｌ一ｔｗｉ１，９８３年是种目前用于研究微生物群落结构的主要分子生物学方法。变性梯度凝胶电泳的原理是基于１６ＳｒＲＮＡ或１８ＳｒＲＮＡ等基因片段序列具有多样性。在梯度变性剂的影响下，巧螺旋结构解开但不完全分离，不同序列的ＤＮＡ片段在凝胶的不同位置形成特异性的泳带，从而达到分离不同ＤＮＡ的目的。而’‘‘。５端连接上３０ｂ－５０ｂＧＣ夹子（ＧＣ－ｃＤＮＡ在引物ｐｐ的ｌａｍｐ），可使双螺旋分子在电泳时更好的分离。根据不同细菌泳带的位置、数目、丰度，可Ｗ判断微生５８＇５９］ｔ物种类多少、构成比例等信息。ｔｔＷＰＣＲ－ＤＧ畑技术己广泛应用环境微生物气食品等领域的菌群结构分析，ｅ－但用来分析婢的带菌情况则很少。ＧｕｂｂｌｓＭＪ等将ＤＧＧＥ与ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＬＢ结合研究婢（寄生于环形泰勒虫患牛）体内环形泰勒虫的种群结构，证明ｗｉｉＣ－宿主可能将特殊基因型的环形泰勒虫传递给碑ｌａｕｄｉａ等利用ＰＣＲＤＧＧＥ对；ｗｉｔ镜子硬婢全蜗检测，发现篤子硬蜗体内存在立克次氏体、己尔通氏体属Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、包柔氏螺旋体、血己通氏体属Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、葡萄球苗属（）口ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、红球菌属Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、假单胞菌属Ｐｓ州ｄｏｍｏｎａｓｓｐ、莫拉）（）（）菌属Ｍｏｒａｘｅｌｌａ似及共生菌柯克斯氏体属和立克次氏体属等多种菌属；Ｏｖｅｒｂｅｅｋ（ＬｔＷ等证明不同地区镜子硬婢体内细菌种群结构不同；ＴｖｅｔｅｎＡＫ等检测到篇子ｓｍａ硬婢体内除了己报道的常见病原外还存在螺原体（ｐｉｒｏｐｌａｓ），并首次发现６５ａ［］Ｓｅｇｎｉｌｉｐｒｕｓｒｕｏｓｕｓ感染镜子硬婢的情况。ｇ分析婢类的带菌情况对研究婢类生理和婢传病具有重要意义，因为峭携带４ 第一章文献综述６６一一［１有多种微生物，其中些对人和动物具有致病性，另些则与婢有共生关系其中消化系中的共生菌能产生多种活性物质，如维生素和其他营养物质，这些对婢类生长发育具有重要贡献；婢消化道的正常菌群结构对抵御外来菌侵入与定殖６７［］至关重要。病原生物在吸血过程中进入蜡类消化系，繁殖、发育后，从中肠－－转移至唾液腺，随唾液注入宿主，故消化系是病原传播媒介宿主三者的关键接触点，中肠内微生物研究具有公共卫生意义。至于其他部位的细菌及其意义则因缺少资料尚难定论。 湖南农业大学硕±学位论文第二章蜡的形态学和分子生物学鉴定为确定采自湖南省衡阳地区山羊体表雌雄成婢，本研究采取形态学方法和分子生物学方法结合策略进行鉴定。ＩＴＳ－婢的形态学观察借助体视显微镜进行。婢的分子生物学鉴定通过１和－－Ｃｏｘ１ＩＴＳｌＩｎｔｅｍａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳａｃｅｒｓ打Ｓ基因片段分析实现。（ｐ，）是不成熟核糖－体，Ｃｏｘ１是细胞色素氧化酶的基因。由于这两个基因分别在不同寄生虫虫属和属种间具有明显的差异性，被广泛用来鉴定寄生虫种属和同种属的亲缘关系远近－分析，但存储了大量的遗传信息。另外，Ｃｏｘ１细胞色素氧。虽然基因长度较短化酶基因由于在进化的过程中容易出现变异，导致该基因呈多样性，因此适合用一－１－１物种的亲缘关系，于鉴定同。本研究通过对ＩＴＳ和Ｃｏｘ基因分析设计特异性引物用于鉴定嫌形扇头魄，为嫌形扇头婢的鉴定研究提供材料。２．１材解与方法２丄１材料２丄１．１待检婢实验用牌来自衡阳市毛个县２１个乡镇的山羊体表。１）主要试剂（①柱式ＰＣ民产物纯化试剂盒：天恩泽生物工程公司；ＰＭＤＴ试剂念②１８；大连宝生物科技有限公司；：ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｍｉｎ旧ＥＳＴＰＩａｓｍｉｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ：大连宝生物公司③酶；④Ｋ蛋白酶：Ｍｅｒｋ公司；ＴＤＮＡ连接酶；Ｐｒｏｍｅａ⑤４ｇ公司；ｌＯ感受态细胞：大连宝生物科技有限公司⑥Ｔｏｐ；口）主要仪器ｔａｍ２３０６①体视显微镜（Ｍｏｉｃ）：麦克奥迪实业集团有限公司；一－６Ｃ②电泳系统（ＤＹＹ：北京六实验仪器有限公司）；：Ｔａｎｏｎ公司③凝胶成象系统；④高速台式离也机（ＬＥＧＥＮＤＭＩＣＲ０１７）：Ｔｈｅｒｍｏ科学仪器厂；６ 第二章轉的形态学和分子生物学鉴定ＢＣＤ－２５４Ｉ⑤恒温冷藏箱（：德国ＳＭＥＮＳ股份有限公司）；⑧梯度ＰＣ民扩增仪（２７２０ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司；⑦恒温隔水培养箱：湖北恒丰实验医疗器械公司；⑨紫外透射仪：广州深华生科公司；⑨超净工作台：ＡＩＲＴＥＣＨ实验设备有限公司；⑩微量取液器：上海ＤＲＡＧＯＮ科学仪器有限公司；２．１．２方法２丄２．１待检婢的形态学鉴定取新采的活婢Ｗ７０％的酒精洗洛干净，于体视显微镜下观察体表的各器官、结构，并拍照。２丄２．２待检碑的分子生物学鉴定ｅｎＢａｎｋＳ－－基于Ｇ中鎌形扇头婢ＩＴ１和Ｃｏｘ１两基因序列（ＫＷ５８３８５、－０８３５％ＩＴ－ＫＭ），ＷＤＮＡＭＡＮ软件设计Ｓ１和Ｃｏｘ１扩增引物，由博尚生物科－技公司合成。引物信息见表２１；表２－１ＩＴＳ－和Ｃ－１１ｏｘ扩増引物及其信息－ｆｏＴａｂｉｉｆｈｉｉｈａｌｕｉｄｈｈｄｌｅ２１ＩｎｒｍａｔｏｎｆｓｉｃｔｏＲｃｅｓｈａｅｍａｈｓａｌｏｅｓａｅｍａｌｉｄｂａｓｅｏｐｅｃｐｐｐｙｐｙｓａｏｅｓｏｎＩＴＳ－－１ａｎｄＣｏｘ１’名称序列信息产物长度退火溢度ＣＩＴＳ－ＩＴＣＡＴＡＡＧＣＴＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴｆ１７７４ｂｐ５２ＩＴＳ－１ｒＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣｏｘ－ＩＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＧｆ７５５ｂｐ５３Ｃｏｘ－１ｒｇｇｃｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔａｔｔａｔａａｃｌＤＮＡ提取（）①取饱血雌成魄３只，用７０％酒精洗緣，滤纸吸取银形扇头碑体表残余酒．，，研磨成粉末状５ｍｒｉｎ精加入液氮；加入ＳＤＳ裂解液０＾４０００；放入研体ｐ５ｍｎ，取上清。离也ｉ°②加卽Ｌ蛋白酶Ｋ，于５６Ｃ水浴中作用化，１２０００ｒｐｍ离也３ｍｉｎ；移上清液至离也管，加入等体积的酶，振荡混合成乳状，１２０００ｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ。一⑤将上层水相层移至另只洁净的离瓜管加入等体积的氯仿／异戊醇溶液，；一、混匀１２０００ｒｐｍ离必Ｉｍｉｎ将样液上层水相转移到另洁净离也，加入上层；管７ 湖南农业大学硕±学位论文２．５０．１体积的乙酸钢溶液（３ｍｏｌ／ＬＨ５２水相液倍体积的无水乙醇和，ｐ．），上°４－５２０００ｍ下轻缓颠倒离也管次，使溶液充分混匀Ｃ，１ｒｌＯｍｉｎ，；４ｐ离也弃上清液。④加入原始样品２倍体积预冷的７０％乙醇至试管中，离也１２０００ｒｐｍ，离也５ｍｉｎ，弃上清液。５一⑤室温放置１ｍｉｎ，待样液中的艺醇完全挥发，最后加入定体积的ＴＥ溶液或双蒸水重新溶解使ＤＮＡ沉淀。２ＩＴＳ－１Ｃｏｘ－（）和１扩增一Ｌ－２洁净的〇．５ｉ试管，按表２依次加入各试剂，制备反应体系１５ｉＬ。①取＾＾表２－２ＰＣ民反应体系Ｔａｂｌｅ２－２ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ试剂体积ＨＬ化９酶０．３０ｂｕｆｆｅｒ１．５０ｄＮＴＰ０．８０Ｔ－－ＩＳＩ或Ｃｏｘ．ｆＩｆ）０３０（打－－０Ｓ．３０１ｒ或Ｃｏｘ１ｒ）（ＤＮＡ模板０．５０ｄｄＨ２〇补至１５②按下列程序进行ＰＣ民扩增：＂９４Ｃ预变性５ｍｉｎ＂＂９４Ｃ变性１ｍｉｎ°＾３５个循环５３Ｃ退火３０ｓ°７２１．４一Ｃ延伸５ｍｉｎ／５ｓ°７２Ｃ延伸７ｍｍＰＣ民６．（Ｌ．５产物，加至％琼脂糖凝胶点样孔中，于１２０Ｖ下电泳③取上述Ｖ１２０ｍｉｎ〇④借助凝胶成像系统观察、拍照。３ＰＣ民产物纯化（）天恩泽公司的柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒回收ＰＣ民产物扩增电泳，具体操作方８ 第二章婢的形态学和分子生物学鉴定法和步骤见下：一新的①将胶方至紫外透视仪下，用刀片切取含有目的条带，放入ＩｍＬ离也管内。，称重°Ｒ３－５ｆｆｅｒ②向ＰＣ反应管中加倍体积的Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕ，混匀５０Ｃ水浴，溶胶液，１０ｍｉｎ。，室温下静置３ｍｍ，１２０００ｒｍｍｉｎ，③移至离也吸附柱，套上液体收集管ｐ离也Ｉ弃废液。④加入０．８ｍＬ洗柱液，室温静置２ｍｉｎ，１２（Ｋ）０ｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ，弃废液。一⑤将离必柱装入洁净塑料离必管，加入１００［ｉＬ通用洗脱液，室温静置３ｍｍ，１２０００ｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ。°－⑧洗脱液，于２０Ｃ保存。４－１ｏｘ－１ＴＡ打Ｓ和Ｃ：（）与克隆载体连接—一①取洁净的１．５ｍ旧Ｐ，按下表配制反应体系管。表２－３ＴＡ克隆连接体系Ｔ２－３ＳａｂＩｅｙｓｔｅｍｆｏｒ化ｅｖｉｇａｔｉｏｎ试剂体积ＨＬＭＤ⑥－１ＴＶｅｃｒ１．ｐ９ｔｏ０ＩＴＳ－１Ｃ－１５０或ｏｘ片段０．加Ｈ２０３．５０Ｓｏ山ｔｉｏｎＩ５．０②混匀°，１６Ｃ下连接过夜。例转化ＭＤ－－①取ｐ１９ＴＩＴＳ（或ＭＤ１９ＴＣｏｘｌ）连接液５．０，加入ｌＯＯ＾ＬＴｏｐｌＯ感ｐ阵，受态细胞，冰浴３０ｍｉｎ期间数次摇动离也管。°立即插入４２ｓ②取出离必管，Ｃ温水中９０。，解育°２ｍｈＬ的ＬＢ３７③取出离必管，插入ｉ入８０（ｉ，Ｃ冰水中；加Ｈ液体培养基于进行振摇ＩＳＯｒｐｍ培养３０ｍｉｎ。④取出培养液，４５００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ，弃上清液。⑤加入１００１１＾１＾６培养液菌滴管反复吹打，使之成为悬液。＾，＾灭⑥取悬液０．５ｍｌ，滴于含氨节霉素的ＬＢ固体培养板上，用Ｌ型涂布棒将菌°液涂布均匀，倒置平放，３７Ｃ培养箱内培养１６ｈ。９ 湖南农业大学硕±学位论文佑）培养°ＬＢ培养Ｃ、培２４ｈＬＢ５①挑取白色菌落，接种于液，３７养。取培养液．０ｍＬ，１２０００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ，弃上清液。天恩泽试剂盒提取质粒，过程如下：②将溶液Ａ液与ＲＮａｓｅＡ溶液混匀。２５③移上述溶液（ＨｉＬ至细菌沉淀，Ｗ吸头反复吹打，使沉淀完全悬浮。加入２５（ＨｉＬ溶液Ｂ，颠倒混匀直至溶液变粘；冰浴，静置５ｍｍ。④加入溶液Ｃ３５０叫颠倒混匀５次，见到白色沉淀物产生后，置于冰面操作台上５ｍｉｎ。°⑤４Ｃ下，１２０００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ；将上清液转移到离也吸附柱静置５ｍｉｎ。在室温下，１２，０００ｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ，弃废液。５００１１＾的通用洗柱液１１＠加入，室温，１２０００巧〇１１１加＾，离也弃废液。⑦重复第６，１２０００ｒｍ离必Ｉｍｉｎ，。步。室温，ｐ弃废液（ＴＣＤＮＡ，⑨将离也吸附柱放入大号塑料离也管中，加入１０〇ｎＬ８的洗脱液室温，放置２ｉｎｉｎ。１２，０００巧ｍ离必Ｉｍｉｎ，离也管底部即质粒ＤＮＡ。（７）鉴定－－－①取质粒ＰＭＤ１９ＴＩＴＳ１或ｐＭＤ１９ＴＣｏｘｌ，表２４中的引物进行扩增，扩增产物电泳。表２－４ＩＴＳ－１和Ｃｏｘ－１扩增引物及其信息Ｔ－Ｉ－－ｉＲ．ｈｉｄｄｏｎｄａｂＩｅ２４ｎｆｂｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｆｉｃｏａｅｍａｈｓａｌｏｅｓｂａｓｅＩＴＳ１ａｎＣｏｘ１ｐｔｐｙ名称序列信息退火温度’ｃＭ１３ｆｃｇｃｃａｇｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃ５５Ｍ１３ｒａｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａ１２．２参数扩增。扩增产物于１．５②按．．２琼脂糖凝胶电泳。有预计大小扩增片段者视为阳性。８测序及序列分析（）ＭＤ１９Ｔ－ＩＴＳ１和ｐＭＤ－ｏｘｌ①取经鉴定为阳性的质粒Ｐ１９ＴＣ各１０叫送往华大基因公司进行测序。②下载Ｇｅｎｂａｎｋ的其他扇头婢的基因序歹！Ｊ，用ＤＮＡＳｔａｒ软件中Ｍｅｇａｌｉｎ程序对序列进行同源性分析。２丄２．３衡阳地区嫌形扇头婢的分布调查衡阳地区下辖７个县、市，２１个乡镇。为了确保调查不发生遗漏，本研究１０ 第二章碑的形态学和分子生物学鉴定，每乡选３个村，每村查３只羊。２．２结果与分析２．２１．待检蜗的形态结构２１．２丄嫌形扇头婢雌虫雌成婢假头短；假头基背观六角形，宽约为长的２．２倍。侧沟明显，有零散。粗刻点联串，末端延至眼后孔区呈直立卵形，间距约为短径的１．５倍。口下短－－，２１。板，齿式３Ｉ３每纵列约１０１１枚。见图違誦图２－１雌蜡的假头和假头基Ｆ－１ｅａｓｅｉｇ２ｆａｌｓｅｈｄａｎｄ杞Ｉｈｅａｄｏｆｆｅｍａｌｅｔｉｃｋｓ雌成碑盾板卵圆形一眼点呈长卵，，长略胜于宽后缘圆铺。盾板两侧各有，－２圆形。见图２。图２－２雌蜗盾板、眼点Ｆ２－２Ｆｅｍａｅａｅｅｅｓｓｉｌｔｉｃｋｓｓｈｉｅｌｄｌｔｏｔｇ，ｙｐｐ雌成婢肛沟位于肛口之后，具肛后中沟。后端有缘巧１１个，且十分明显。２－见图３。１１ 湖南农业大学硕壬学位论文￣岡哪图２－３雌蜗的化沟和缘操Ｆ２－ｌａｎｄｃｒＦｅｍａｅｋｎａｌｄｎｄｃｒｉｇ３Ｆｅｍａｌｅｔｉｃｋｓａｎａｄｉ化ｈｉｂｌｔｉｃｓａｉ化ｈａｉｂ－雌成婢足粗细均匀，ｖ有短粗外距。基节Ｉ外距直较内距稍短。基节ｉｉｉ，一－ｉｖ按节序渐小后内角均扁锐，。谢节ｎ腹面末端有略微的尖齿亚末端具短；小的纯齿２－４。。爪垫中等大小。见图图２－４雌婢的内距Ｆ－４Ｆｅｍａｅｃｒｖｌｉｇ２ｌｔｉｋｉｎｔｅａ。帷成碑气口板短逗点形，长大于宽（包括背突），背突短粗，末端几乎平纯－５见图２。，图２－５雌蜗的气板Ｆ２－ｌｉ５Ｆｅｅｔｉｃｋｓａｓｌａｅｇｍａｇｐｔ２．２丄２嫌形扇头婢雄虫１２ ＇第二章婢的形态学和分子生物学鉴定，，，雄成婢假头基呈六角形宽约为长的２．２倍侧角明显约位于前１／３的水－，末端稍尖２。平基突相当粗大。见图６；图２－６雄蜗的假头基Ｆ２－Ｍａｅｃｓｓｅｉｇ６ｌｔｉｋｏｆｂａ一雄成婢盾板卵圆形，长略胜于宽，后缘圆纯。盾板两侧各有卵圆形眼点，－７略微凸起。见图２。２－７雄蜡的盾板图、眼点－ＭａＦｉ２ｌｅｔｉｃｋｔｔ．７ｓｓｈｉｅｌｄｐｌａｅｅｅｓｏｇ，ｙｐ，。雄成碑侧沟窄而深，有粗刻点联串自眼后延伸后中沟前前窄后宽，约为１／３盾板长的，末端伸达当中的缘煤。后侧沟短，呈不规则的Ｈ角形。内缘中部２－８强度凹入，其下方凸角明显；后缘与外缘略直或微弯。见图。１３ 湖南农业大学硕±学位论文■隆一一图２－８雄蜗的阻沟和缘巧－Ｆｉ２８Ｍａｌｅａｎａｌｄｉｔｃｈａｎｄｅｄｅｔｋｓｃｒｉｂｇｇｉｃ足粗细均匀。基节Ｉ外距较内距短。基节ＩＩ、ＩＩＩ外距短粗；后内角扁锐。基一－节ＩＶ外距和内距均短。附节ＩＩＩＶ腹面末端和亚末端各具齿突。爪垫约及爪长２－之半。见图９。＇’豚．渐化始切．满：：Ｍｍ图２－９雄蜗的内距Ｆ２－Ｍｌｉｇ９ａｅｔｉｃｋｉｎ化ｒｖａｌ气口板水滴形，，，长大于宽（包括背突）背突短粗末端几乎平纯。见图２－１０。戀＞＾雜２－图１０雄婢的气板Ｆ２－１０Ｍａｅｅｉｇｌｔｉｃｋｓａｓｌａｔｇｐ１４ 第二章婢的形态学和分子生物学鉴定由雌雄成婢假头基六边形可肯定：待检婢属扇头婢属。由雄婢肛侧板呈鎌刀形可Ｗ确定：待检婢属扇头婢属待检碑应为嫌形扇头婢。－－２．．２２待检蜗ＩＴＳ１和Ｃｏｘ１克隆、测序２２打Ｓ－－１１．．２．１待检婢和Ｇｏｘ的扩增打Ｓ－－Ｗ特异性引物扩增，１和Ｃｏｘ１７５０ｂ产生片段，产物大小分别为ｐ和一２０００ｂ－与预计大小。详见图２１１。ｐ，致Ｍａｉ２ＣＫＸ｝＾ｉ画＾Ｈｇ￣￣Ｉ贿０—１０００￣７５０＞－＾７Ｓ〇ＯＯ－＾ＨＳ５００－＾＾ｍ２５０＾２－＾５０－！００＞－ｎ＞１００２－图１１采集蜡虫的ＩＴＳ！和Ｃｏｘｌ基因扩増结果－Ｆ．２１１ＩＣＴ１ｉｏｌｌｅｃ１：ｅｄｔｉｃｋｓｏｆＩＳ１ａｎｄＣｏｘｅｎｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｒｅｓｕｌｔｓｇｇｐ注：ａ为ＩＴＳｌ基因ＰＣＲ产物电泳图，ｂ为Ｃｏｘｌ基因ＰＣ民产物电泳图Ｎｏｔｅ，：ａｅｎｅｆｂｒｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓＩＴＳｌｏｆＰＣＲｒｏｄｕｃｔｓｂｉｓＣｏｘｌｅｎｅｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣ民ｒｏｄｕｃｔｓｇｐｐｇｐｐ－－２．ｏｘｌ．２．２２待检婢ＩＴＳｌ和Ｇ的克隆－ｏｘ－，培养后分别将ＩＴＳ１和Ｃ１与Ｔ载体连接产物转化巧１０，长出大量；白色菌落－。，挑取白色菌落进行ＰＣＲ鉴定。结果见图２１２ＭａＭｂ２—＾ＣＸＭ｝－－ＪｈＩＩＩ呼—＞５觀ｓｍ，阮＇－ｎ？＊－２５０２５０＾Ｉ－－ＭＤ－图２１２ＭＤ１９ＴＩＴＳｌ和１９ＴＣｏｘｌ质粒电泳图ｐｐ＂Ｆ２－１２ＭＤ１Ｔ－ＩＴｌ－Ｃｌｒｅｓｉ９ＳａｎｄＭＤ１９Ｔｏｘｌａｓｍｉｄｓｅｌｅｃｔｒｏｈｏｉｓｇｐｐｐｐ－泳图－；ａＭＤ１ｏｘＭＤ注为ｐ９ＴＣｌ质粒电，ｂ为ｐ１９ＴＩＴＳＩ粒电泳图Ｎｏｂ－－：ａｌａｓｍｉｄｆｏｒＭＤ１９ＴＣｏｘｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｂｉｓＭＤ１９ＴＩＴＳｌｒａｉｎｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓ，ｐｐｐｐｇｐ１５ 湖南农业大学硕±学位论文ＩＴ－－２１１．２２．３Ｓ和Ｃｏｓ基因测１序结果－－经测定，打Ｓ１序列长度为１７７４ｂｐ；Ｃｏｘ１基因序列长度为７５化Ｐ。－ＩＴＳ１测序结果：１０２０３０４０５０６０ＴＣＡＴＡＡＧＣＴＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴ７０８０９０１００１１０１２０ＡＡＧＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴ０１７０１３０１４０１５０１６１８０ＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＡＴＡＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣ１９０２００２１０２２０２３０２４０ＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＧＣＣＣＧ２５０２６０２７０２８０２９０３００ＴＡＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴ３１０３２０３３０３４０３５０３６０ＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴ３７０３８０３９０４００４１０４２０ＡＣＧＧＧＴＡＡＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡ４３０４４０４５０４６０４７０４８０ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＧＧＣＡＣＧＧＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＡＣＧＡＡ４９０５００５１０５２０５３０５４０ＡＡＡＴＡＡＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＧＡＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＴ５５０５６０５７０５８０５９０６００ＴＴＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣＡＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡ６１０６２０６３０６４０６５０６６０ＡＴＡＧＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＴＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＧ６７０６８０６９０７００７１０７２０ＡＧＴＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＧＡＴＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴ７３０７４０７５０７６０７７０７８０ＧＣＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ八ＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＣ７９０８００８１０８２０８３０８４０ＡＡＣＧＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＴＴＣＴＧ１６ 第二章蜡的形态学和分子生物学舊定８５０８６０８７０８８０８９０９００ＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＣＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＧＧＧＡＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＣＡＴＴＣＧＴＡＴ９１０９２０９３０９４０９５０９６０ＴＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＡＡＧＡＣＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧ９７０９８０９９０１０００１０１０１０２０ＣＣＡＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧ３００４０１０５０１０６０１０７０１０８０１０１ＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡＣＴＣ００２０３０４０１０９０１１０１１１１１１１１１ＧＧＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＣ１１００１１５０１６０１１７０１８０１１９０１２ＴＧＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＴＧ２２３０４０２５０２６０１１０１２２０１１２１１ＡＣＴＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＧＣＴＣ１１２７０１２８０１２９０１３００１３１０３２０ＴＴＴＣＴＴＧＡＴＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＴＧＴＣＴＧ６００３８０１３３０１３４０１３５０１３１３７１ＧＴＴＡＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣ１１３９０４００１４１０１４２０１４３０１４４０ＴＴＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＡＧＧＴ１４５０１４６０１４７０１４８０１４９０１５００ＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＣＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＣ４００６０１５１０１５２０１５３０１５１５５１５ＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＴＡＡＣＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧ１１５７０１５８０１５９０１６００１６０１６２０ＧＣＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＧＣＧＡＧＴＣＡＴＡＡＧＣＴＣＧＣＧＴＩ６３０１６４０１６５０１６６０１６７０１６８０ＴＧＡＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＡＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧ１１１６９０１７００１７１０１７２０７３０７４０ＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＧＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴ１１７５０１７６０１７７０１７８０Ｉ７９０８００１７ 湖南农业大学硕－±学位论文ＧＡＣＣＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣｏｘ－１测序结果：１０２０３０４０５０６０ＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＡＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＡＡＴＡＡＧＡＡＴＡ７０８０９０１００１１０１２０ＣＴＡＡＴＣＣＧＡＡＴＡＧＡＡＣＴＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴ１３０１４０１５０１６０１７０１８０ＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＡＴＣＡＴＡＡＴＣ９０２００２１０２２０２３０２４０１ＧＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＧＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡ２５０２６０２７０２８０２９０３００ＣＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴ３１０３２０３３０３４０３５０３６０ＴＣＡＴＴＡＧＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＴＡＡＣ３７０３８０３９０４００４１０４２０ＣＴＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡ４３０４４０４５０４６０４７０４８０ＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＴ４９０５００５１０５２０５３０５４０ＡＴＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡ５５０５６０５７０５８０５９０６００ＣＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＴＴＣ１０６２０６３０６４０６５０６６０６ＡＡＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴ６７０６８０６９０７００７１０７２０ＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴ７３０７４０７５０７６０７７０７８０ＣＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＣ２２－－ＩＴ１ｏｘ１．２．．４待检婢Ｓ及Ｃ基因同源性分析ＩＴ－本研究测出的Ｓ１基因序列与Ｇｅｎｂａｎｋ内所登录的鎌形扇头婢（登录号为ＤＱ８３９５５２巧同源性为１００％；囊形扇头婢（登录号为ＡＪ００３８１６）；血红扇头峭１８ 第二章婢的形态学和分子生物学鉴定（登录号为ＡＪ００３８１５ＬＸ９８７４９７Ｌ７６３４２）图兰扇头婢（登录号为ＫＦ９５８４４７，，，；９５８４５２９９％左右Ｉ－ＫＦ９５８４５１，ＫＦ）的同源性均为。待检婢ＴＳ１序列与本属其他－－１２脾ＩＴＳ序列比较结果如图１３。１ＰｅｒｃｅｎｔＩｄｅｎｔｉｔｙ＿１２３４５巧７巧９ＩＩＩＩＩ！Ｉ！ＩＩ寒贾度卒舜９９．９９９．９９９．９９９．９９９．９９９．９９９．３１｜防．２Ｑ，．Ｏ９９．９９９．９９９．８９９．８９９．８９９．７２Ｉ纖Ｓ｜滋树刪００９９９９９３ｋｓｓ３０．１１００．１００．０１００．０１０．０．．８巧刪！！農患杂親§４０．１０．１０．０ｍ１００．０１００．０１００．０９９．９９９．８４星桌惠某巧５４Ｓ５ｑ．，ｊ５０．１０．１日．００．０日日．０１００．０白９．９９９．８５ｋ巧姐巧冲，Ｂ非桌帛洁該！壓坛０．．．．．呈巧Ｓ某銳．１０．２００００００Ｍｌ品＾９９９９９８６！晦Ｉ９９自：？？５８巧．，７０．１０．２０．００．００．００＇０■Ｉ．９９９．３７１立度头兹［｜８０．１０．２０．１０．１０．１０．１０．１９９．８８；丘註哀头５，赛ｆｉＸＳ７４３７ｌ９０．２０．３０．２０．２０．２０．２０．２０．２Ｂｎ＆丘包磨其該山ｓ泌｜—１３４５６７８３ｊＩＩ２ＩＩ［２－－图１３ＩＴＳＩ序列与其他蜗种的序列同源性分析Ｆ－－ｍａｉ２１３ＩＴＳ１ｓｅｕｅｎｃｅａｎａｕｅｎｃｈ化ｔｉｅｃｉｅｓｇｑｌｙｓｉｓｏｆｓｅｑｅｏｍｏｌｏｇｙＷ她０ｅｒｃｋｓｐｐＣｏｘ－本研究测出的１（序列号ＫＭ０８３５９３）的序列与Ｇｅｎｂａｎｋ内登录的扇头（碑的序列进行比对分析，发现所采集的婢种序列信息与嫌形扇头婢ＪＱ７３７０８５）的同源性为９９．３％，而与短小扇头婢（ＡＹ００８６８４，ＨＭ１９％７７，ＨＭ１９％７８），血红扇头婢（ＪＱ７３７０８４，ＫＦ２００１１２，ＫＦ２００１１３，ＫＦ４３７５４３），图兰扇头婢（ＪＱ７３７０８６，ＫＭ２３５７１７，ＫＭ２３５７１８，ＫＭ２３５７１９）等其他扇头婢种的同源性在－－８６．４１。．７％８９％之间。表明ＩＴＳ基因在扇头峭属内相对保守Ｐ斜说能松够—＇＾２３４５Ｊ９１Ｑｊ１１ｉ１２１３＇＇［‘辆４３１２Ｃｋｍ３互刊？：１巧７Ｓｇ〇Ｓ１４召１３５１Ｉ弓３８９１１縣５滅５１愛莫庶黑該．２，＾１—三Ｊ：’：２０３ｍ９９１狗巧？９０？削９８９ｃＴ２疼黒煮崇臻ｃｋｍ王巧７巧＂￣￣．＇’１５■■＾§４鼓３而４§０本而４０？！９９Ｄ３孤５削各縣ａ絲２４犀当运其諮（ｋｍ三巧？巧：，１００吞的９Ｉ呂９谷５‘ｇ化．５ＨＩＩ縣名淵也８贫？訓８６５．５立替方茄综；片《１三７乂立：＾．＇！＂￣￣ｔ式—心，——……聋Ｌ…§６ｌ〇３９ｉ０２４苗自六三ＷＬ。：，Ｔ７ＢＴ骑孩矿航担注房去詰〔ＫＦ．Ｉ？＿Ｈ１西７！￥＾…＾－章—＊眷＇导苗日．２而８；＞品；：致？言早’安？：７＾＾己立窝把該：苗門放担ｔ：．＂‘＇＊辩‘ＳＳ６Ｓ－８，０５．８０．３０５０３８Ｔ５４獄１良呑８８赛６８丘若：度其該好ｉｉ３：．Ｉ１１９重互的？巧１９９１－一料巧３巧？＞．１８Ｗ２１３９１４０１３４１３９３？客。８６１９巧户垣其該：；‘＇’—一…．…￣而巧而互＾马ｒ皆而而而而而。■Ｂ取而Ｔｆ而巧旁茜該：恍－化巧巧受巳．＂￣￣’’＇？－：，ｌｉ：Ｔ１ｒｉ化〇＾做巧＾ＩＪ专§．奪１攝Ｔ复ｅ３４存玄洁ｎＦｉＴｅ留ＰＢｆｓｉＴ运户璋争姨＇ｕＴ２ｉ巧２Ｖ，Ｓ７３１４６１３；７请５１车３４８旅涼誠近了＇，＞＞［；与卸＇麵：—査蚕互；１＂ｔ《１３１Ｚ邑—１２０．７１２每ｔｓａ本８４７Ｕ３Ｓ６１４Ｄ巧４化７１３者寅绘字魏編觀挽３Ｘ：；＾：ＨＨ＿＾Ｊ＜图２－１４Ｃｏｘ－１序列与其他赠种的序列同源性分析Ｆ－－ｃｅｍｏｗｏｅｒｃｓｅｃｅｓｉ２１４Ｃｏｘ１ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｅｑｕｅｎｈｏｌｏｇｙｉｔｈｔｈｔｉｋｐｉｇ２２ｒｒＳ－－．２．．５ｌＣｏｘｌ基因系统进化树分析，９１ 湖南农业大学硕±学位论文－Ｗ灯Ｓ１基因序列为基点，绘制进化树如图。本实验所采集的嫌形扇头婢的基因序列与登录号为ＤＱ８３９５５２的亲缘关系最近，与种间的图兰扇头婢、囊性扇头牌、血红扇头婢差异也很小。．云安兹？另，ＩＩ巧巧妄头级ＤＱＥ巧巧２Ｌ；＿＿．＇－—ｖｖｖｖｖｗｖｖｖ、—…通了—星吉．；烹妾漁！—星ｉＭＩ悄空Ｍ巧扭Ｉ２签旱羣爭譚辦巧担巧．，！ＳｉＳ－＇ｉｆｔ击Ｓ■ｔｉＴＶＯａＳ＊ｃｉ１ｉ左包Ｂ其ＡＸ£巧ｉ：ｉ［邱＾－互ＵＳ其試哪識巧．，直扛哀其襄；＿１７５５４２：，■Ｉ０Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ如ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｆｉｓ３ｄ如（）２－ＩＴ－图１５Ｓ１序列与其他蜡种的进化树分析－－Ｆｉ．２１５ＩＴＳ１ｓｅｕｅｎｃｅｗ０ｒｉｅｃｅｓｌｏａｎｇｑｉｔｈ也ｅｔｃｋｓｐｉｈｅｎ幻ｉｃａｌｓｉｓｐｙｇｙｏｘ－ＷＣ１基因序列为基点，绘制进化树如图。本实验所采集的嫌形扇头牌－１基因的进化树显示７３７０８５Ｃｏｘ，本实验所采集的嫌形扇头婢与登录号为ＪＱ的鎌形扇头婢亲缘关系较近，，而与其他种的扇头婢亲缘关系较远具有明显的分支。ＣＫＭ２３５７ｉ７：？＇一、ｆ！Ｔ山＊占ｉｓＩ＂■，，，ｗ？Ｉ。＞冷巧抓一芒Ｓ支、ｎ。：；巧；，Ｓ巧乏；Ｉ—、．Ｉ、＜ＷＷＶＷＶＩ：圍ｙ。—屋嘉獻殘：立泣袁头簽巧躬巧－广Ｃ４３：＾如’巧＇Ｌ写头怒？Ａｎｉ！；备一去５，？、？＞？－．—．．—二．？，一＾Ｍ只４巧；＇Ｌ：巧公拓ｌｉ２：—己达哀其誤刀＇。．－？Ａ：－：Ｊ．切妨－＇＾——：空〇：佈１１？２口３寅头譯：一．一＇：、，！＊占．－Ａ．Ｗ—？．—…＇味―＊＿＇、广Ｗ広５ｄ巧；，１Ｔ，ＡＳ３ＳＥ．＇一一？、一’．，．．．．化汾、ｌ．１１．Ｊ《Ｋ从游＇￣＾一玄去运亨巧；村拇５５巧３：１９．ＩＩ１Ｉ６４２０２－－图１６Ｃｏｘ１序列与其他魄种的序列进化树分析Ｆ－－．２１６１ｕｅｎｃｅｗｉｅｕｅｎｃｅｒｓｉｏｅｎｅｉｓｓｉｇＣｏｘｓｅｑｔｈｔｈｅｓｑｓｏｆｏｔｈｅｔｉｃｋｐｅｃｅｓｐｈｙｌｔｃａｎａｌｙｉｇ２．２．３衡阳地区编形扇头虫卑的分布２．２．３．１分布调查情况与结果２０ 第二章婢的形态学和分子生物学鉴定２０１４年５月，对衡阳地区下辖７个县、市２１个乡镇各点山羊进行体表检查，２－５采集婢虫。采样时间、地点和结果如表。结果表明：本次检查的７个县市的２１个乡镇的散养山羊身上均发现婢虫寄生。表２－５衡阳地区山羊体表蜗采集情况Ｔａ２－５ｒｅｏｎｏａｓｃｂｉｌｅＨｅｎａｎｇｉｔｋｉｎｔｉｋｔｈｅｃｏｌｌｅｃｔｏｎｇｙｇｇ采集地采婢情况采蜡时间县乡总数雄婢雌婢５５０３２１８集镇衡南县花桥镇２０１４．５．１４８２１１７２５４咸塘镇１１１山都镇１６１６３２来阳市大市乡２０Ｈ．５．４３２１３１９４南阳镇１２６１５松柏镇３４１２２２常宁市塔山乡２０１４．５．８３６２２１４罗桥镇２８１７１１粮市镇５１４］１０祁东县洪桥镇２０１４．５．１１４７２３１４双桥镇３５２３１２向阳镇４３３２１１２０１４．５．１衡阳县Ｈ１３５５４０５塘镇西渡镇２５１６９营洲镇３４２３１１衡山县白果镇２０１４．５．１７２８１２１６东湖镇３２１９１３城关镇４０８３２衡东县大浦镇２０１４．５．２６２８１０１８Ｈ３２１３１９棒乡２．２．３．２鎌形扇头碑在衡阳地区分布示意图２１ 湖南农化大学硕±学位论文＝＝＝将婢带回实验室，形态学法进行鉴定，。体视显微镜下观察似嫌形扇头魄者，视此地有鎌形扇头婢分布：除个别乡外衡阳绝大部分县乡的山羊均有。发现２－１嫌形扇头婢寄生，该碑在衡阳地区的分布如图８。？山＂街巧％巧／巧－、＇、ｆ。》＼狂１—＾．Ｖ有鎌形扇头婢，市．ｆ和一Ｔ２－阳地区分布示意图图１８编形扇头轉在衡－Ｆｉｇ．２１８ＲｈｉｐｉｃｅｐｈａＵｉｓｔｉｃｋｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｄｉａｇｒａｍｉｎＨｅｎｇｙａｎｇ２．３讨论形态学方法和分子生物学方法鉴定表明，采自湖南省衡阳地区山羊体表的大多数待检蜡为嫌形扇头婢。通过体视显微镜观察嫌形扇头婢雄婢与雌婢的假头、假头基、盾板、眼点、肛沟、缘操、内距、气板的形态结构符合《中国经济昆虫志》（１９７８年版，３５册，基本可Ｗ确定采自湖南省衡阳地区山羊体表的婢）中嫌形扇头婢的形态特点为鎌形扇头碑。考虑到观察着对肛侧板形态判断的主观性，笔者进行了分子生物学法鉴定。本研究测出的－１ｅｎｂａｎｋＩＴＳ基因序列与Ｇ内所登录的嫌形扇头婢同源性为１００％；与种内的囊形扇头婢、血红扇头婢、图兰扇头蜗的同源性均为９９％左右。ＩＴ－１－１基因的进化树其同源性比较显示，Ｓ分子序列种内同源性差异较小。ＩＴＳ显示，本实验所采集的鎌形扇头婢的基因序列与登录号为ＤＱ８３９５５２的亲缘关系ＴＳ－最近，与种间的图兰扇头魄、囊性扇头婢、血红扇头婢差异也很小。综上，Ｉ１基因相对保守，不适合做婢种间鉴定。－待检婢Ｃｏｘ１序列与Ｇｅｎｂａｎｋ内所登录的扇头婢的序列进行比对分析，发９３％，现所采集的婢种序列信息与雜形扇头蜡的同源性为９．而与短小扇头婢、血红扇头牌－－、图兰扇头婢等其他扇头脾种的同源性在８６．７％８９．４％之间。表明Ｃｏｘ１２２ 第二章婢的形态学和分子生物学鉴定一ｘ－１基因在扇头碑种内存在定差异性。Ｃｏ基因的进化树显示，本实验所采集的德形扇头碑与登录号为ＪＱ７３７０８５的嫌形扇头婢亲缘关系较近，而与其他种的扇－１头蜡亲缘关系较远，具有明显的分支，蜡种间的Ｃｏｘ序列差别较大，可。综上适用于种间鉴定。通过对湖南省衡阳地区的山羊体表婢类调查，发现鎌形扇头婢在衡阳地区是普遍存在的，，填补了镶形扇头婢没有在湖南地区分布的空白丰富了文献资料。一本研究形态学鉴定方法借助的体视显微镜价格便宜，般实验室均有配备能力，。体视显微镜可完全满足观察碑体表器官结构的需要借助照相系统拍摄的照片较手绘插图更全面、直观，比用电子显微镜观察更简单、易行，故认为本研究的方法和结果更具参考和利用价值。２３ 湖南农业大学硕±学位论文第Ｈ章编形扇头蜗带菌情况分析变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｒａｄｉｅｎｔｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓＤＧＧＥ）创立于ｇｇｇｐ，一１９８３年，是种目前用于研究微生物群落结构的主要分子生物学方法Ｗ通＂６ＳｒＲＮＡ１８ＳｒＲＮＡ－用引物扩增１或，通过带ＧＣ夹子（ＧＣｃｌａｍｐ）的引物扩增ＤＮＡＶ’１化之３的５端使片段在ＤＧ畑时分离更好。在梯度变性剂的影响下，不同序列的ＤＮＡ片段在凝胶的不同位置形成特异性的泳带，根据泳带的位置、－数目和丰度，获得微生物种类多少ＤＧＧＥ、构成比例等信息。ＰＣＲ技术已广泛ｔｗｉ应用环境微生物、食品等领域的菌群结构分析，但用来分析婢的带菌情况则很少，本研究拟采用ＤＧＧＥ技术分离、纯化，进而研究雜形扇头婢携带的优势茵种。３．１材料与方法３．１．１材料３丄１．１待检魄本实验用的鎌形扇头婢，来自衡阳市击个县２１个乡镇的山羊体表。３丄１．２试剂及仪器Ｗ仪器一①恒定电压恒定电流电泳仪：北京六电气公司；一ＹＹ－６Ｃ②电泳系统（Ｄ：北京六实验仪器有限公司；）③凝胶成象设备：Ｔａｎｏｎ公司；化ＥＧＥＮＤＭＩＣ民０１７）：Ｔｈｅｒｍｏ科学仪器厂④高速台式离也机；⑤恒温隔水培养箱：湖北恒丰实验医疗器械公司；⑥超净工作台：Ａ１ＲＴＥＣＨ实验设备有限公司；⑦微量取液器：上海ＤＲＡＧＯＮ科学仪器有限公司；⑨ＤＧＧＥ变性梯度凝胶电泳仪系统：北京君意东方电泳设备有限公司；倒试剂①Ａｃｉｙｌａｍｉｄｅ：Ｐｒｏｍｅｇａ公司；２４ 第ｓ章巧形扇头婢带菌情况分析②Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：Ｐｒｏｍｅｇａ公司；③ＴＥＭＥＤ：ＴＥＭＥＤ；：华美生物技术有限公司④过硫酸钱；⑤细菌生化鉴定管：杭州天和微生物试剂有限公司；’’－－⑥引物：３１８Ｆ：５ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’’９０７Ｒ－－３：５ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ，３４ＦＧＣ５－１ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧ’ＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’’５－－１８民：５ＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３⑦其他试剂：见第二章。３１２．．方法３丄２．１婢体内细菌提取取饱血雌性成婢，０ｓ于乃％乙醇浸泡婢９；移至研体中，加液氮，研磨成粉；加无菌生理盐水５（Ｋ）｜ｘＬ，混匀，２０〇ｘｇ离也Ｉｍｉｎ，取上层液。３丄２ＤＮＡ提Ａ．２细菌基因组取试剂盒提取细菌ＤＮ①取上述上层液ＩｍＬ，１２０００ｒｍ离也Ｉｍｉｎ，弃上清液ｐ；２００＾缓冲液ＧＡ②向沉淀中加入，用移液器吹打使菌体彻底悬浮叫；③向管中加入２０以Ｌ的蛋白酶Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ），颠倒混匀；°④向管中加入２２０曲缓冲液ＧＢ，震荡１５ＷＣ，７０Ｃ水浴ｌＯｍｉｎ，待溶液变清亮后，简短离也；２２０＾⑤向管中加入，充分混匀，简短离也叫无水乙醇；一⑧将溶液和絮状沉淀都转移至个吸附柱ＣＢ３中，１２０００ｒｍ离也３０ｓｅｃ。ｐ弃废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中；⑦向吸附柱中加入５００阵ＧＤ缓冲液，１２０００ｒｐｍ离必３０ｓｅｃ，弃废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中；⑨向吸附柱ＣＢ３中加入６００阵ＰＷ漂洗液，１２０００ｒｐｍ离也３０ｓｅｃ，弃废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中；⑨重复步骤８；⑩将吸附柱ＣＢ３放回收集管中，１２０００巧ｍ离也２ｍｉｎ，倒掉废液，将吸附柱ＣＢ３置于室温数分钟，Ｗ彻底瞭干吸附柱材料中残余的漂洗液；２５ 湖南农业大学硕±学位论文３一⑩将吸附柱ＣＢ放入个干净的离必管中，向吸附膜中央部位悬空滴加－ＴＥ２－２ｍ５０２００ｍｍ，１２０００ｒｍｉｎ阵洗脱缓冲液，室温放置５ｐ离必，将溶液收集到离必管中；）ｍ离必２ｍｉｎ喔将离必得到的溶液再加入吸附柱中，室０００ｒ温放置２ｍｉｎ，１２ｐ，滤出的溶液即细菌基因组ＤＮＡ，收集到离必管中。３丄２．３细菌基因组ＤＮＡ１６Ｓ出ＮＡＶ３区扩增（１）细菌１６ＳｒＤＮＡＶ２一Ｖ４区制备①Ｗ样品基因组ＤＮＡ为扩増模板，Ｗ３１８Ｆ和９０７Ｒ为引物，扩增细菌１６Ｓ出ＮＡ。反应体系为２０阵：样品ＤＮＡ叫Ｌ、上流弓Ｉ物（３４１Ｆ）１曲、下流弓Ｉ物°２ｘ巧０７民）１、（）ＥｓａｙＴａＭｉｘｔｕｒｅ１０阵、超纯水７ｉＬ。反应程序参数：９４Ｃ，冲ｐ＾°〇‘００５ｍｍ３０ｓｅｃ５７２．０７ｍ．；９４Ｃ，；６１．Ｃ，３０ｓｅｃＣ，Ｍｓｅｃ７２．（ＴＣ，ｉｎ４（ＴＣ，。；；；循环３２次。．５％，电泳条件为８０Ｖ、１００ｍＡ、５０ｍｉｎ琼脂糖凝胶电泳；于凝②产物于１；胶成像系统下观察。２细菌１６Ｓ瓜ＮＡＶ３区制备（），３４１ＦＧＣ５１８Ｒ①Ｗ上述ＰＣＲ反应体系为扩增模板Ｗ和为引物，扩增细菌制备１６ＳｒＤＮＡＶ３区。反应体系为５０阵：上述ＰＣ民样品ＤＮＡ２曲；上流引物３４＾〇１流引物５１８艮１曲巧］＼４＾２５２１。（分阵；下（）咕；祖；超纯水阵反应程序参°°°°．：５ｍｉｎ；％Ｃ，３０ｓｅｃ６６Ｃ，３０ｓｅｃ２０Ｃ１２ｓｅｃ７２．０Ｃ，ｉｎ数；；７，；７ｍ；°４．０Ｃ，循环３５次。５，②产物于１．％琼脂糖凝胶电泳电泳条件为：８０Ｖ、１００ｍＡ、５０ｍｉｎ凝；于胶成像系统下观察。３丄２．４细茵１６Ｓ瓜ＮＡＹ］片段变形梯度凝胶电泳①取ｌＯＯｍＬ小烧杯２只，分别配制３０％变性剂胶和６０％变性剂胶；其中３０％变性剂胶的配制方法如下：尿素２．５２ｇ，去离子甲醜胺２．４ｍＬ，４０％丙赌醜胺３．５７５ｍＬ，５０ｘＴＡＥ４００＿ｉＬ２０ｍＬＴＥＭＥＤ１７ＬＡＰＳ，加水定容至，ｉ，１０％８５阵。｜｜６０％变性剂胶配制方法如下：尿素５．０４ｇ，去离子甲醜胺４．８ｍＬ，４０％丙稀醜胺ｘ３．５７５ｍＬ，５〇ＴＡＥ４０（ＶＬ，加水定容至２０ｍＬ，ＴＥＭＥＤ１７｜ｉＬ，１０％ＡＰＳ８５｜ｉＬ。②将島浓度胶和低浓度胶分别倒入左右进胶杯中，打开蠕动累，制备变性梯度胶板；静置２０ｍｉｎ，令胶凝固。２６ 第Ｈ章潇形扇头婢带菌情况分析⑨将１６ＳｒＤＮＡＶ３区样液加入点样孔；于６（ＴＣ，１８０Ｖ，５０ｍＡ下预电泳１５ｍｉｎ，再电泳化电泳结束后，将胶剥离、展开、于稀战液（１０ｘＬ／４００ｍＬ）２０ｍｉｎ。｜中染色④观察、拍照。３丄２．５切胶回收、克隆和测序，ｄｄＨ〇洗洛３次，捣碎①切取ＤＧＧＥ凝胶中清晰明显的条带２，加入无菌’生理盐水４０ｉＬ，４Ｃ过夜；｜②１２０００ｘｇ离也过夜产物５ｍｉｎ，取上清液５阵，Ｗ３４１ｆ和５１８ｒ为引物，扩增，扩增条件同１．２１。．琼脂糖凝胶电泳检测ＷＤＮＡ片段快速纯化／回收试剂；盒回收ＰＣ民产物；°－③取回收产物４咕、ＰＭＤ１８Ｔ载体１叫Ｓｏ山ｔｉｏｎＩ５阵，１６Ｃ条件下连接１２ｈｒ。连接产物转化于ＥｃｏＤＨＸ－ａ、．ｌｉ５ａ感受态细胞ＧｌＩＰＴＧ和氨节；涂布于含青霉素的ＬＢ固体培养基，３７Ｃ振荡培养１２ｈ。挑选单个白色茵落于含Ａｍｐ的°ＬＢ液体培养基，３７Ｃ振荡培养１２ｈ；④Ｗ高纯质粒小提试剂盒提取质粒；取质粒７叫Ｅｃｏ民Ｉ、ＸｈｏＩ各ｌｉａＬ°１０ｘＨＢｕ抵ｒ２阵，ｄｄ＆Ｏ９ｍＬ，３７Ｃ酶切１ｈ。，有预计大小片段者视为阳性⑤电泳检查。酶切检测阳性质粒送生工生物工程股份有限公司测序。３丄２．６数据处理将所测序列与ＧｅｎＢａｎｋ登录序列ｂｌａｓｔ，寻找亲缘关系最为相近的菌种及克隆ａｎｉｔＯｎｅ４．６．２。用Ｑｕｔｙ对ＤＧＧＥ图谱进行分析。３丄２．７细菌的分离、鉴定１，、无菌水条件下将经＾％酒精浸泡消毒的饱血雌成婢研磨液接种于ＬＢ°培养平板－７２ｈ，３０Ｃ培养４８；２、挑选单菌落，按照《实用临床微生物学检验与图谱》观察细菌形态结构，测定细菌理化特性。３．２结果分析３．２．１细菌１６ＳｒＤＮＡＶ区扩増３一Ｖ①细菌１化ｒＤＮＡＶ２４区制备Ｗ３１８Ｆ和９０７民为引物，扩增婢细菌基因组ＤＮＡ，产物大小约为６００ｂｐ，２７ 湖南农业大学硕±学位论文一－与预计大小致，结果见图３１。１２３＾师ＨＰ＾１胃１甲＾ＰｐＳ＾ＳＳＲＷＢ１、，２０００ｂ。ｔ，—＿；以．ｔ；＊，［节；ｆ■（！＂；ｌ〇〇ｉ巧，本产：知？＾資縣７巧削－巾，＇巧。谢＂，－Ｉ２沒〇（》Ｈ１〇〇１＞１＞騷子Ｈ３－１１６ＳｒＤＮＡ一Ｖ图蛛细窗Ｖ２４区扩增片段Ｆ－ｍｅｎＶ一ｉＦａｏｆ化ｅ１６＾化ｅｂａｃｒｆｒｏｍ化ｉｇ．３１ｒｇｔｓｓ瓜ＮＡ２＼４ｏｆｔｅｉａ６ｔｃｋ②细菌１６ＳｒＤＮＡＶ３区制备Ｗ３４１Ｆｇｃ和５１８民为引物１６ＳｒＤＮＡＶ２００ｂ，扩増制备３区，产物大小约为ｐ，一－与预计大小致，结果见图３２。１２３ｉｉ＂ｆｓ片；Ｂｐ麵巧外？，ｉｐＳｔ巧ｔ％巧巧；ｉ＾巧＊Ｓ＂咖Ｗ＇１３－２蜗６Ｓ图细菌ＩｒＤＮＡＶ３区扩增结果－２Ｆ巧３ｒａｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅ１６ｓＤＮＡＶｏｆ化６ｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｔｈｅｔｉｃｋ咨ｇｒｓ３ｉ．２．２ＤＧＧＥ检巧ｌ吉ｊ果银形扇头婢饱血雌成魄细菌－。１６ＳｒＤＮＡＶ３区片段ＤＧＧＥ结果如图３３圓二■二ＰｇＹ６Ｖ７Ｙ８—Ｙ９３－３１６ＳｒＤ图蜗细菌ＮＡＶ３区ＤＧＧＥ结果Ｆｉ３－３ＤＧＧＥｒｏｆｉｅＰＣ民ｒｏＶ１ＮＡｒｒｃｇｌｓｏｆｄｕｃｔｓｏｆ３ｏｆ６Ｓ瓜ｏｆｂａｃｔｅｉａｆｏｍ化ｅｔｉｋｓｐｐ２８ 第Ｈ章鎌形扇头婢带茵情况分析■３．２．３优势条带的测序和比对结果－比对结果如表３１所示，９条明显条带的序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中某些序列高度相似。３－表１ＤＧＧＥ胶中回收条带序列分析结果Ｔａｂ－ｒｎａｌｅ３１ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｉａＯｂｔａｉｎｅｄｂｙＳｅｑｕｅｎｃｉｎＡｌｓｉｓｏｆＤＧＧＥＢａｎｄｓｇｙＢａｎｄｓＡｃｃｅ％ｉｏｎＮｅａｒｅｓｔｍａｒｃｈＩｄｅｎｔｉｔｙＹ１ＫＣ７７６３１８ＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄＣｏｘｉｅｌｌａｓｐ．１００％Ｙ２ＪＱ４８０８２４Ｃｏｘｉｅｌｌａｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔ９８％Ｙ３ＧＵ３３９２９７Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｌｅｃｏｌｏｓｓｉｃｉｄａ９８％ｐｇＹ４ＡＭ２３７０８８Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．９９％Ｙ５ＡＹ３４２０３６Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｏｎｇｉｃｏｍｉｓｓｙｍｂｉｏｎｔ９７％Ｙ６ＫＪ６８５３％Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ９９％Ｙ７ＨＥ％２２８３Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ１００％Ｙ８ＮＲ０４４５２７Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ９６％Ｙ９ＪＦ３６９１２５Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｓｏｉｌｂａｃ化ｒｉｕｍ９７％３．２．４细菌的分离鉴定－－－从饱血雌婢分离（Ｒｈ１２）。Ｒｈ１、纯化获得２株细菌和趾细菌在普通琼脂－１平板上形成圆形凸起，表面光滑，，边缘整齐不透明的白色菌落。Ｒｈ为革兰氏ｌ阳性球菌，菌体直径．Ｏｉｍ。ｊ一Ｒｈ－２细茵在普通琼脂平板上形成圆形、有光泽的白、边缘不规则、大小不－ｘ色菌落。趾２为革兰氏阳性杆菌，菌体大小为１．０５鄭ｍ，产芽抱。－？？一ＲＷ？ｉ－Ｒｈ＊？＊？／／、？＇心．ｔｒＶ＊＞－、？？？，？、＊八之，？、、々＊、、，？、护，？？Ｉ＞，＼吃拳．？？３－４细菌革兰巧染色结果ｉ＊－ｅＦｉ．３４Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉａｍｓｓｉｎｉｎｇｇｇ２９ 湖南农业大学硕±学位论文－－ｈ－３２Ｒｈ１和Ｒ２细菌的生化特性如表。表３－２Ｒｈ－１和Ｒｈ－２细菌的生化特性－２－－Ｔａｂｌｅ３ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＲｈ１ａｎｄＲｈ２ＭＭ＾革兰氏染色＋＋氧化酶一＋触酶＋＋半纤维素酶＋无精氨酸＋无尿素酶＋无０－乳糖＋无甘露醇＋无旗糖＋无Ｄ－葦糖＋无丙丽酸＋无一一Ｄ－木糖甘露醇一－淀粉支链淀粉一无（）阿拉伯糖一无鸟氨酸脱幾酶一无卵磯脂酶无＋酪蛋白水解无＋明胶水解无＋硝酸盐还原无＋Ｄ－海藻搪无＋葡萄糖无＋呵嗯反应无一发酵搪类产气无一ＶＰ试验无—－１－综合两株２株细菌（Ｒｈ和Ｒｈ２）的菌落特点、菌体形态、理化特点，认－－为Ｒｈ１为模仿葡萄球菌，Ｒｈ２为蜡样芽袍杆菌。３．３讨论镶形扇头婢广泛分布于我国的河北、广东、江苏、浙江、江西、福建、台湾、安徽、广西、湖北、海南、湖南、河南、贵州、云南、迁宁、西藏等地，在国外分布于印度、细甸、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、己基斯坦等国家，侵袭３０ 第Ｈ章谦形扇头碑带菌情况分析水牛、黄牛、猪、驴、犬、山羊、绵羊、野猪、猫、黑熊、狼、野兔、水鹿等，有时也侵袭人：是马己贝斯虫病、牛己贝斯虫病、吉氏己贝斯虫病、梨形虫病的传６８Ｗｔ］播媒介。本研究结果表明；湖南省衡阳地区大量存在鎌形扇头蜗，提示今后本地发展草食动物养殖业应注意防治该碑传播的疾病。研究结果表明，在鎌形扇头婢雌成婢中至少存在４个属（９株）、３个属（５２株）、个属（４株）的微生物。巧！Ｉ序、比对分析的９个明显条带序列，与假单胞菌属ｅｕｄｏｍｏｎａｓｓ．、涅斯捷连科氏菌属Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ、、柯克斯氏体属Ｐｓｐ芽抱杆一菌属Ｂａｃｉｌｌｕｓ的细菌１６Ｓ瓜ＮＡ有较島相似性，与前人结果基本致。Ｃｌａｕｄｉａ等－ＤＧＧＥ对镜子硬利用ＰＣＲ婢全婢检测，发现篇子硬婢体内存在立克次氏体、己尔通氏体属Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、包柔氏螺旋体、血己通氏体属Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、葡萄球菌属Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、红球菌属Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、假单胞菌属Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ巧．莫拉菌属７Ｇ］ＴｖＭｏｒａｘｅｌｌａＷ及共生菌柯克斯氏体属和立克次氏体属等多种细献ｅｔｅｎＡＫ；ｔＷ等报道了柯克斯氏体、假单胞菌及婢共生菌在篇子硬婢体内寄生的情况。与他人结果有相似之处，如；徐兴莉ＷＤＧＧＥ法研究微小牛蜗中肠菌群结构，认为：微小牛魄中肠有：普氏立克次体、蒙他拿立克次体、孔雀立克次氏体、图兰扇头婢体内的共生柯克斯氏体、犬埃立克体、假单胞菌、黄单胞菌等８种微生物。杨亚发现：立、；獨黄血婢中肠的常在菌为克次氏体属柯克斯氏体属、假单胞菌属、７２＾［葡萄球菌属、大肠杆菌属等。李春红从Ｈ种未吸血硬碑（长角血碑、亚洲璃Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｎｏｓａ眼蜡、鎌形扇头婢）肠道内分离出铜绿假单胞菌ｇｉ、芽抱杆ｔｎｉ菌属２种细菌。一本试验中ＤＧＧＥ回收条带结果与细菌培养结果不尽致，可能是因为回收的ＤＧＧＥ条带为优势条带和优势条带对应的细菌为不可培养所致。嫌形扇头婢雌成婢的４株细菌分别为：ＣｏｘｉｅｌｌａｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔｏｆＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｔｕｒａｎｉｃｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ＾Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｏｎｇｉｃｏｍｉｓ巧ｍｂｉｏｎｔ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ。Ｎｏｄｅ等认为引起Ｑ热的病原菌贝氏柯克斯氏体化ｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ）能感染４０多种婢，可分布于婢体的卵巢、马氏管内、唾液腺、中肠和血淋己，Ｋａｃｈｋｏ并通过繁殖在种群内扩飯气ｌｙ等证实柯克斯氏体菌可在花碑的卵巢、马氏管内、唾液腺、中肠寄生，与其呈共生关系气３１ 湖南农业大学硕古学位论文结论１．通过形态学方法和分子生物学方法鉴定采自湖南省衡阳地区山羊体表的婢虫进行鉴定，结果表明：在衡阳地区采集的碑虫是嫌形扇头婢，也证明了在衡阳地区是普遍存在镶形扇头蜗的。２－１ｎｋ．衡阳地区采集的婢虫的ＩＴＳ与Ｇｅｎ純ａ中的ＤＱ８３９５５２２（嫌形扇－头碑）同源性是１００％。衡阳地区采集的婢虫的Ｃｏｘ１与ＧｅｎｅＢａｎｋ中化７３７０８５（嫌形扇头婢）同源性为９９．３％。暗示：它为嫌形扇头魄。－－ＩＴＳ１比较保守，不适于种的鉴定Ｃｏｘ１测序种间差异较小，；测序种－间差异较大，Ｃｏｘ１可Ｗ适用于种间鉴定。３Ｒ－ＤＧＧＥ．通过ＰＣ技术对鎌形扇头婢雌成婢的菌群结构分析，可Ｗ得出：嫌形扇头婢雌成婢中至少存在４个属（９株）、３个属（５株）、２个属（４株）的微生物。本研究对鎌形扇头婢的自带菌群分析对其传播媒介的维生素合成，营养物质吸收，抵御外来菌侵入与定殖，Ｗ及公共卫生方面具重要意义。３２ 参考文献参考文献１．．．１９９９．［］朱林学，李冠群学驳婢叮咬１例报告［Ｊ．中国皮肤性病学杂志，朱］２１－１：０５０５，（）－２：１５５５５．．沙连艺扣例森林脑炎病例分析町中国中医药咨讯２０１０．０２９１［］口）３．包喜军戴宗浩刘占斌等Ａ［］．硬脾致犬神经麻瘦的诊断与综合防治措施．，，，［］第十Ｈ次全国养犬学术研讨会论文集００９．，２［４．秦志辉，周洪福．碑类染色体的核型研究进展阴，蛛形学报，１９９７，６１：］（）７４－８０．５．李连化峭虫病防治四措施化农民科技培训２０１０（１１）：２６．［］，，６．．陈泽中国魄类的系统分类及两种硬婢的生物学特性分析［Ｄ．石家庄：河北［］］师范大学，２０１０．７．Ｒａｚａａｂｕｂｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｏｆａｍｂｌｓｅｉｕｓｂｅｒｌｅｓｅａｎｄｎｅｏｓｅｉｕｌｕｓｈｕｈｅｓａ［］ｙｙｇ（－ＣａｒｉｎａｔｔＤ．Ｄｔｔｔｔ；ｐｈｙｏｓｅｉｉｄａｅｏｆｕｎａｂａｋｉｓａｎｅａｒｍｅｎｏｆａｒｉ．Ｅｎｏｍｏｌｆａｃｕｌ）ｐｊｐ［］ｐｇｇｙｏｆａｃｕｌｔｕｒｅｕｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆａｃｕｌｔｕｒｅｆａｉｓａｌａｂａｄ２００８．ｙｇｒｉ，ｙｇｒｉ，，．．杨晓军．０７５０９：脚，陈泽，刘敬泽魄类系统学研究进展ｍ昆虫学报，２０，（）９４－１９４９．９．梁文琴杨茂发谢丽霞．大翼甲瞒科分类研究进展及展望：［］，，（蜡蝴亚纲甲瞒目２０１０２９５３８－５４３：大翼甲蝴总科．山地农业生物学６：．）饥报，，（）１０．郭莉．．［］，毛光琼，吴宣，等蜡及蜗媒疾病的危害及防治［Ｊ］四川畜牧兽医，２０１０巧２４９－５０：．，叫）１１．陈也陶徐秉鑑．９５９，［］，我国十年来婢魄类调查研究综述［Ｊ］动物学杂志，１，１０．一１２．．金道超雄尾魄属新种和中国已知种记述婢满亚纲：雄尾瞒科）［Ｊ］．贵［］（－州农学院学报１９９２１１：５８６４．，，口）１３．４，为金华黄佳亮．海南岛小兽类寄生魄的群落结构１９９［］Ｊ，口］动物学研究，，１５４４５－４８．：（）＂１５ＫＤＢＴＴｔＨｔｓｔｔ．ＭｃＣｏｏｕｌｉｎｉｅｒｉｒａｒｄＣｅａｌ．ｏｓｅｃｉｆｉｃｉｔｏｆａｅｎｅｒａｌｉｓａｒａｓｉｅ：［］ｙ，，，ｐｙｇｐｇｅｎｅｔｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｓｙｍｐａｔｒｉｃｈｏｓｔｒａｃｅｓｉｎｔｈｅｓｅａｂｉｒｄｔｉｃｋＩｘｏｄｅｓｕｒｉａｅＪ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［］３３ 湖南农业大学硕±学位论文ＥｖｏｌｕＢ２００１１４３％－４０５ｔｉｏｎａｒｉｏｌｏ３：．ｙｇｙ，，（）１６Ｊ．Ｐａｔｈｏ．ＳａｍｉｓｈＭ民ｅｈａｃｅｋｅｎｓａｎｄｒｅｄａｌ：ｏｒｓｏｆｔｉｃｋｓａｎｄ也ｅｉｒｏｌ；ｅｎｔｉａｌｉｎ［］，ｇｐｐ＊－ｂｉｏｌｏｉｃａｌＣＯ打ｔｒｏｌＪ．Ａｎｎｕａｌｉｅｖｉｅｗｏｆｅｎｔｏｍｏｌｏ１９９９４４１：１５９１８２ｇ［］ｇｙ．，，（）－１７ｅｈｍｅ民ＨａｒｔｅｌｔＫａｃｋｅＨｅｔａｌｏｃｉｏｆｔｉｃｋｂｏｒｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｓｏｕｔｈｗｅｓｔ．ＯＢ．Ｆ［］，，，Ｇｅｒｍａｎ．Ｊ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２００２２９ｓｕｌｙ］ｇｙ，１［，ｐｐｌ－３３：２２２９．（）－１８ｅＢ．Ｅｓｅｓｔ．ＤｕｍｌｒＪＳａｋｋｅｎＪＳｈｒｌｉｃｈｉａｌｄｉｓｅａｏｆｈｕｍａｎｓ：ｅｍｅｒｉｎｉｃｋｂｏｍｅ［，］ｇｇｃ－ｔｎｃａｎｆｅｔｏｕｓｅａｓｅｓ１２０５１１０２１１１ｉｎｆｅｉｏｎｓＪ．Ｃｌｉｉｌｉｃｉｄｉｓ９９５：０．［］，，（）１９．ＢｅｍａｓｃｏｎｉＭ乂ＶａｌｓａｎｇｉａｃｏｍｏＣ良ａｌｍｄｌｉＴｅｔａｌ．Ｔｉｃｋｚｏｏｎｏｓｅｓｉｎｔｈｅ［］，，ｓｏｕ化ｅｍｐａｒｔｏｆＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄａｎｔｏｎＴｉｃｉ打ｏ：ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＢｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ（Ｃ）ｇｓｅｎｓｕｔｔｔｓＪ．Ｅｏｕ１ｌａｏａｎｄＲｉｃｋｅｉａｓｕｒｏｅａｎｒｎａｌｏｆｅｉｄｅｍｉｏｌｏ１９９７３２：ｐ［］ｐｊｐｇｙ，，（）２０９－２１５．２０么Ｚ．Ａｎｔｔｔｔｔ．Ｈｕｂｌｅｋａｎｎｏａｅｄｃｈｅｃｋｌｉｓｏｆａｈｏｅ打ｉｃｍｉｃｒｏｏｒａｎｉｓｍｓａｓｓｏｃｉａｅｄ［］ｐｇｇＷ－ｗｉｔｈｍｉｒａｔｏｒｂｉｒｄｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｌｄｌ报Ｄｉｓｅａｓｅｓ２００４４０４：６３９６５９．ｇｙ［］，，（）２１．赵秋敏．王［］，吴晓明，张泮河，等种婢媒传染病在媒介魄和鼠类中复合感染２００５２６－１的研究［Ｊ．中华流行病学杂志１：３．］，，（）９Ｋ（２２Ｄｔｔ．ＷｉｌｌａｄｓｅｎｅｍＨ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉ化ｃｏｎｃｅａｌｅｃＴａｎｉｅｎｓｆｂｒｉｃｋｃｏｎｔｒｏｌＪ．［］ｐｇ［］Ｐａ－ｒａｓｉｔ：ｏｌｏＴｏｄａ１９８８４７：１９６１９８．ｇｙｙ，，（）２３．．．陈泽杨晓军，杨晓红，等中国峭类地理分布及区系分析机四川动物，［］，２００８２７５２０－：８８２３．，（）．．．石家庄４长角血碑的野外生态学研究Ｄ］：河北师范大学．口］郑洪远．２００９［２５．杨劲松．５，郭养淳袁青桂，等外耳道微小牛婢寄生附例报告Ｊ．福［］，（）［｜ｌＳ－？８３３．建医药杂志：３０３３，，）（２６Ｊ，寄生虫与．罗礼搏郭宪国．云南省小型兽类体表寄生革瞒多样性分析，［［］］医学昆虫学报２００７４０－１４：４４．，，。）２７．曹玉梅．罕见外耳道婢寄生致面神经麻搏１例的治疗体会机．，李登平中［］－国社区医师综合版２００６２３２３９４．（），，（０－２８．经济昆虫志Ｈ十九册邓国藩．中国Ｍ．第蜡瞒亚纲》硬蜗科北［］，姜在阶［］，京科学出版社１９７８．，２９．．１．吴克强９８７［］，王学国安徽省家畜硬婢类调查报告ｍ中国兽医杂志，，３－：３０３４，（）３４ 参考文献３０．．Ｄ蔡其芯南台灣灰駒蘭體外寄生蟲之研究［．屏東科技大學野生動物保育［］］２０１化－研究所學位論文，１６７．－３１．ＢａｓａｎｏｖａＡＶＢａｓｋｏｖａＩＰＺａｖａｌｏｖａＬＬ．Ｖａｓｃｕｌａｒｌａｔｅｌｅｔａｎｄｌａｓｍａ［］，，ｐｐｈｅｍｏｓｔａｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ疗ｏｍｂｌｏｏｄｓｕｃｋｉｎｇａｎｉｍａｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ化ｙ（Ｍｏｓｃｏｗ），２００２，－６７１：１４３１５０．（）３２．Ｐｕｍｅｌｌ民Ｅ，ＪｏｎｅｒＬＰ．ＴｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆＴｈｅｉｌｅｒｉａａｒｖａｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒ［］ｙｐｐｙｔｈｔｉｃｋＲｈｉｉｈｌｅｎｄｉｃｓＰａｉｔｌ１９６８５８ｌａｎｄｓｏｆｅｃｅａｕｓａ山ａｔｕ．ｒａｓｏｏ：ｇ，ｐｐｐｐ口］ｇｙ，，口）７２５－７３２．３３．杨晓军，陈泽，刘敬泽．蜡类系统学研究进展．屋虫学报，２００７，５０９：［］口］（）９４１－９４９．３４．．．陈俊锋分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用Ｊ［］，俞纯方，黄兵，等［］２００６２７５－动物医学进展：２３２７．，，（）．３５．刘明社黄克峻Ｊ，，赵中夫，等九省区蜡类区系初步调査长治医学院学［］，［］２００５４－２５０报，１９：２４９．，（）３６．．林开铅Ｊ．［］，陈天锋，陈华福建省鎌形扇头碑的扫描电镜观察［］福建农学院－学报：．，１９９１，２０口２１６２１９）［３７］．蔡美满，吴文珊，张彥杰．利用普通光学显微镜拍摄小型昆虫［Ｊ］．生物学教２０１２－３６３．学：％，（）３８．ＢａｌｄｗｉｎＢＧ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｕｔｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｉｎｔｓｔＪ．Ｍｐｌａｎ：ａｎｅｘａｍｐｌｅｆｒｏｍ出ｅＣｏｍｐｏｓｉａｅｏｌｅｃ山ａｒ［］－ｈｌｏｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ１９９２１１：３１６．ｐｙｇ，，（）［３９］．吴群，姬可平．ｒＲＮＡ基因内转录间福区作为遗传标记的应用现状及前景２００８１１１２－２８０８Ｊ．．时珍国医国药９：８０６［］，，（）４０．ＣｈｉｔＬＬｉｎ民ＩｔＭｌｔｉｍｉａＣｏｓｏｒｏａｂａｅａｌ．ｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃ：ｅｒｉｚａｉｏｎｏｆｈａｒｄａｎｄ［］，Ｑ，，ｓｏｆｔｔｉｃｋｓｆｒｏｍＲｏｍａｎｉａｂｙｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓａｃｅｒｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌｑｐ化ｌ－ＤＮＡＪ．Ｐａｒａｓ１７１１．ｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ２００９０５４：９０９［］ｇｙ：，（）＇－４１．ＰａｒｏＰ民ｔＤｔｌＥＪ．Ｃｌａａｏｕｌ．Ｔｉｃｋｂｏｍｅｂａｃｅｒｉａｄｉｓｅａｓｅｓｅｍｅｉｉｎ；ｎｕｒｏｅｌｉｎｉｃａｌ，［］ｇｇｐ［］－ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２００１７２：８０８３．ｇｙ，，（）４２．ＬａｂｍｎａＭ良了ＨｅＭＢｔ．ｔｔＩＭａｒｒｅｌｌｉＭｉ打ｅｍａｍｉｅａｌＴａｘｏ打ｏｍｉｃｓａｕｓｏｆｘｏｄｅｓ，，，［］ｄｉｄｅｌｐｈｉｄｉｓ（Ａｃａｒｉ：Ｉｘｏｄｉｄａｅ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｅｄｉｃａｌｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，２００２，３９（１）：１－１４２３５．３５ 湖南农业大学硕击学位论文－．张艳艳刘维荣薄新文■ＩＴ．，等四种璃眼贼Ｓ２基因的序列分析口寄生［巧，，］２０１２１４２４－虫与医学昆虫学报：１２４７．，９，（）４４．ＬｉＪＡｌｅｘａｎｄｅｒｌｉｉＪｅｔａｌ．Ｐｈｏｅｎｅｔａｔｏ打ｓｈＥｍｌＷａｒｄＴｌｉｃｒｅｌｉｉｓｏｆｅｒａｃｅａｅ［］，，，ｙｇｐｐｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｅｎｅｍａｔＫａｎｄｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＩＴＳｑｇａｔｃｓａｎｄｔｏ打２５－ｒｅ：３１５ｉｏｎ？Ｍｏｌｅｃｕｌｒｈｌｏｅｎｅｉｅｖｏｌｕｉ２００２２３０６．ｇ口］ｐｙｇ，，（）４５ＡｎＪｅｅＹＪＫｔｔ．ＨＳＭｉｎＳｅａｌ．Ｐｈｌｏｅｎｅｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｓｉｘｓｅｃｉｅｓｏｆａｃｉｆｉｃ［］，，，ｙｙｐｇｐａｂａｌｏ打ｅａｌｉｏｔｉｄａｅｂａｓｅｄｏｎＤＮＡｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆ１６ＳｒＲＮＡａｎｄｃｔｏｃｈｒｏｍｅｃ（Ｈ）ｑｙ－ｏｘｔＪ．Ｍ２００５４７３ｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＩｍｉｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｅｓａｒｉｎｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ７：３３８０．ｇ［］ｇｙ，，（）４６．Ｊａｍｉｅｓｏ打ＢＧＭＴｉｌｌｉｅｒＳＴｉｌｌｉｅｒＡｅｔａｌ．ＰｈｌｏｅｎｏｆｔｈｅＭｅａｓｃｏｌｅｃｉｄａｅａｎｄ［］，，，ｙｇｙｇＣｒａｓｓｉｃｌｉｔｅｌｌａｔａＡｎｎｅｌｉｄａＯｌｉｏｃｈａｅｔａ：ｃｏｍｂｉｎｅｄｖｅｒｓｕｓａｒｔｉｔｉｏｎｅｄａｎａｌｓｉｓｕｓｉｎ（，ｇ）ｐｙｇｎｕｃｅａｒ２８Ｓａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ１２Ｓ１６Ｓ瓜ＮＡＪ．Ｚｏｏｓｓｔｅｍａ．ａｒｉｓ．２００２２４４：ｌ）（，）［］ｙｐ，（，（）－４７０７７３．４７ＨｕｍａｉｒＰＦＤｏｕｅｔＶＣａｄｅｎａｓＦＭｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｄｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆｂｌｏｏｄｍｅａｌ．，，，［］ｓｏｕｒｃｅｉｎＩｘｏｄｅｓｒｉｃｉｎｕｓｔ１２ａ．ＪｉｃｋｓｕｓｉｎｇＳｒＤＮＡｓａｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒＪｏｕｒｎａｌｏｆ［］ｏ４４－ｍｅｄｉｃａｌｅｎｔｏｍｏ：ｌｇｙ５８６９８８０．，２００７，（）４８．呂继洲，吴绍强，张永ｔ等．小亚璃眼魄，亚洲璃眼蜡和残缘璃眼蜡的分［］－．中国畜牧兽医２０１３４０６：７１４子生物学鉴定ｍ．，，（）４９Ｊ．．高东亚？褐［］，田俊华，覃新程，等黄血魄与铃头血婢的分子生物学鉴定［］１２２３４－２８４中国媒介生物学及控制杂志２０．：２８０，，（）５０田血婢和微小扇头婢的形态与分子生物学．覃新程．长角［］，俊华，王剑波，等－．中华流行病学杂志２０１１３２６１２．鉴定ｍ：６０８６，，（）５１．ＫａＦＡＤＨＶｔ．ＭｔＤＮＡｉｎＤＥＳｅｒｌｉｎＨａｌｅａｌｉｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｅｕｅｎｃｅ，，，［］ｐｇｙｑ－ｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎＩｘｏｄｅｓａｃ巧ｃｕｓＡｃａｒｉ：ＩｘｏｄｉｄａｅＪ．Ｈｅｒｅｄｉｔ１９９９８３４：３７８３８６．ｐ（）［］ｙ，，（）［５２．ＬｕｎｔＤＨ，ＺｈａｎＤＸ，ＳｚｍｕｒａＪＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｎｓｅｃｔｃｙｔ；ｏｃｈｒｏｍｅｏｘｉｄａｓｅＩ］ｇｙｅｎｅｌｔｔｈＪ．Ｉｔｇ：ｅｖｏｕｉｏ打ａｒｙｐａｅｒｎｓａｎｄｃｏｎｓｅｒｖｅｄｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｐｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｎｓｅｃ［］１９９６５３５３－１ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ：１６５．ｇｙ，，（）ＤｕｎｈＨｕｔＣｔＴｈＮＡ５３．ａｍＩｎＡ民ｏｌｌｉｎｓＪＥｅａｌ．ｅＤｓｅｕｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎ［］，，，ｑ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２２Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ１９９４０２６７６１９；４８９４９５．，，（［］）［５４］．ＧｒａｖｅｓＳ民，ＳｂｗａｒｔＬ，Ｓ化ｎｏｓＪ，ｅｔａｌ．ＳｐｏＵｅｄｆｅｖｅｒｇｒｏｕｐｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎ－ｓｏｕｔｈｅａｓｌ；ｅｍＡｕｓｔｒａｌｉａ：ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｋｅ行ｓｉａｅＪ．ｏｍａｒａｔｖｅｉｍｍｕｎｏｏｉＣｐｉｌｇｙ［］，ｍｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄｎｆｅｃｔｉｏｕｓｅａｓｅｓ３１６－：２２３２３３ｉｇｙｉｄｉｓ，１９９３．，（）３６ 参考文献－５５．古小彬余增董杨光友等２．嗜群血婢和长角血蜡ＩＴＳＣＯＩ和ｃｏｎ［］，，，，－Ｊ．２０１０４１６７４６＾４基因序列变异与亲缘关系分析：．［畜牧兽医学报，，］（）５６．Ｂ０ｒｒｅｓｅｎＡＬＨｏｖｉＢｒ０ｅｒＡ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｂａｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｅｎｏｍｉｃ［］，ｇＥ，ｇｇｇＤＮＡｕｓｉｎｇｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅ打ｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｒｚａ－ｈｙｂｉｄｉｔｉｏｎｗｉｔｈｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｂｅｓＪ．ＭｕｔａｔｉｃｍＲｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌａｎｄ［］－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｉｓＭｕｔａｅｎｅｓｉｓ１９８８２０２１７７．ｎｍｓｏｆ：８３ｇ，，（）５７．ＭｕｙｚｅｒＧ，ＢｒｉｎｋｈｏｆｆＴ，ＮｕｂｅｌＵ，ｅｔａｌ．Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓ［］ｇｇｐＤＧＧＥｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏＤ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｏｍａｎｕａｌ．２００４ｌｇｙ（）ｇｙ［］，５８．ＹａｎｅＲｈｉｓｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｒｅｔｏｎｇＣＨＣｒｏｗｌＤＥ．ｚｏｈｅｒｌａｉ［］，ｙｐｙｔｏｒｏｏｔｌｏｃａｔｉｏｌａｎｔｉｒｏｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｔａｔｕｓＪ．Ａｌｉｅｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ１ｌ打ａｎｄｐｎｎｕ：ａ［］ｐｐ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０００６６１：３４５３５１．，，（）口钟ＴｚｅｎｅｖａＶＡ，ＨｅｉｌｉｇＨＧＨＪ，ｖａ打ＶｌｉｅｔＷＡ，ｅｔａｌ．１６ＳｒＲＮＡｔａｒｇｅ化ｄＤＧＧＥｆｉｎｇｅｒｐｒｉ打ｔｉｎｇｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍａ打ｉｔｉｅｓＭ．ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，２００８［］－６０，高惠支吕欣董明盛．ＰＣ民ＤＧＧＥ指纹技，，术在食品微生物研究中的应用［］Ｊ２００５２６４６５－４６８．食品科学８：．，，［］（）－６１．余跃惠．ＰＣ民ＤＧＧＥ方法分析原油储层微生物群落结［］，张凡，向廷生，等２５－构及种群多样性Ｊ：２２４２．．生态学报２００５２３７［］，，（）［６２］．ＧｕｂｂｅｌｓＭＪ，ＫａｔｚｅｒＦ，ＳｈｉｅｌｓＢ民，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｆＴｈｅｉｌｅｒｉａａｎｎｕｌａｔａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｕｒｉｎｂｏｖｉ打ｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｆｏｌｏｗｉｎｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｔｉｃｋｓＪ．Ｐａｒａｓｔｏｏｇｌｇｔｉｌｇｙ［］，２００－１１２３：５５３５６１．，促）６３．ＷａｌｔｅｒＪＨｅｒｔｅｌＣＴａｎｎｏｃｋＧＷｅｔａｌ．ＤｅｌｅｔｉｏｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃＵｌｕｓＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ［，，，，，］Ｌｅｕｃｏｎｏｓ－ｔ：ｏｃａｎｄＷｅｉｓｓｅａｓｅｃｅｓａｎｆｅｃｅｓｂｕｓｉｎｒｏｕｓｅｃｉｃＰＣ民ｌｌｉｉｎｈｕｍｉｆ，ｐｙｇｇｐｐｒＪ．ＡｉｌｐｉｍｅｒｓａｎｄｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｒｏｎｍｅｎｔａｇ［］ｐｐＭ－ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２００１６７６：２５７８２５８５．，，（）６４．ＧａｒｂｅｖａＶａｎＯｖｅｒｂｅｅｋＬＳＶａｎＶｕｕｒｄｅＪＷＬｅｔａｌ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｅｎｄｏｈｔｉｃ［］，，ｙｐｙｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｏｆｏｔａｔｏｂｌａｔｉｎａｎｄｄｅｎａｔｕｒｉｎｒａｄｉｅｎｔｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｐｙｐｇｇｇｇｐＤＧＧＥ、ｏｔ１６ＳｒＤＮＡｂａｓｅｄＰＣ民ｆｒａｍｅｎｔｓＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏ２００１４１４：（）ｇ［］ｇｙ，，（）３６９－３８３．＊６５．ＸｕＸＬＣｈｅｎＴＹａｎＨｅｔａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｉｉ１：ｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔ；ｅｒｉａｌｆｌｏａｉｎ［］．ｉ，ｇ乂ｇ，Ｒｈｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ－ｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓｔｉｃｋｓｂｙｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａＰＣＲＤＧＧＥａｎａｌｓｉｓＪ．ｙ［］Ｅｘｅｒ２５７－２６８ｉｍｅｎｔａｌａｎｄＡｌｉｅｄ八ｃａｒｏｌｏ２０１５：６６２：．ｐｐｐｇｙ，）（３７ 湖南农业大学硕±学位论文６６Ｄ．２０１４．．刘钟．嗜群血婢共生菌的研究［河北师范大学［］］，６７．Ｊ，韩英．微生态制剂益生菌治疗炎症性肠病的作用机理研究进展［中国医［］］５９－药导刊８５：３；３６１．，２００６，（）［６８．邓国藩，姜在阶．中国经济昆虫志，第Ｈ十九册，婢瞒亚纲，硬碑科［Ｍ］．北京：］科学出版社，１９９１．６９．，．陈泽中国碑类地理分布及区系分析ｍ．四川动物，２００８［］，杨晓军，刘敬泽，等２７２０－５，；８８２３（）－７０．ＣｕｄａｅｒｎｅｒＬｕｂｔｚ民．Ａｌｃａｔｏｎｏｆｏａｄａｎｅ１６ＳＲＮＡＰＣ民ｌａｉＳＧＷｉＳａｂｉｎｅｉｉｂｒｒｒ［］’ｐｐｇｃａ－ａｍｐｌｉｆｉｔｉｏｎａｎｄＤＧＧＥｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｉｃｋｉｎｆｅｃｔｉｎｇｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＭｅｔｈｏｄｓ－ｂａｔａｏｕｍａｏｆｃａ５２：２１２６０．；ｅｒｉＪ．ＪＩｇｉｌ２００３２５［］，，（）７１ｖｅ１：ｅｎＡＫ．．ＩｔｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｂｒｉａＩｎｆｅｃｔｎＩｘｏｄｅｓｒｃｎｕｓｃｋｓ．ＴＫｎ山ＫＳｄｅｎｉｆｉｉｉＴｉｂ［］，ｇｙ１６ＳｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＧｒａｄｉｅｎｔＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ．］－－ＶｅｃｔｏｒＢｏｍｅａｎｄＺｏｏｎｏｔｉｃＤｅａ２０１１１ｉ１．ｉｓｓｅｓ〇：１＾９３３４，，ｙ）［７２］？杨亚，刘进辉，程天印，褐黄血魄中肠内容物菌群结构分析［Ｊ］？中国预防兽医学１４２７０－２０５３７．：２７３报，，（）７３．．李春红．Ｈ种硬魄肠道菌群及其部分菌株生物学特性分析［０］硕±学位论文，［］湖南农业大学２０１２．，［７４］．ＮｏｄａＨ＾ＭｕｎｄｅｒｌｏｈＵＱＫｕｒｔｔｉＴＪ．ＥｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔｓｏｆＴｉｃｋｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅＷｏ化－Ｂｏｍｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏａｃｈｉａｓｐｐ．ａｎｄＴｉｃｋｅＰａｔｈｏｇｅｎｓｏｆＨｕｍａｎｓａｎｄＡｎＪ－．Ａｔ！１３９２６ｉｍａｌｓｌｉｅｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ９９７６３０：３９３２．［］ｐｐｇｙ，，（）７５．Ｋｌａｃｈｋｏ０ＳＦｕＶｉｔ：ｅｍＢＤＣｌａｕａｅｔａｌ丄ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｕａｌｉｚａｔｉｏ打ｏｆａ，，，［］ｙｙｑ－ＴＡｍｂｍｂｌＣｏｘｉｅｌｌａｅＳｉｏｎｔｗｉｔｈｉｎｔｈｅＬｏｎｅＳｔａｒＴｉｃｋｏｉｎｍａａｍｅｒｉｃａｎｕｍＪ．ｙｐｙ，ｙ［］Ａｌｔ２００７７２５８４－ｉｅｄａｎｄｅｎｖ．ｉｒｏｎｍｅｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０；６６５９４ｐｐｇｙ，，（）３８ 致谢致谢本论文的撰写工作是在我的导师程天印教授的耐也指导下完成的。在研究生＂＂一学习阶段，先生朴诚奋勉，且直，求实创新这八字校训教导我Ｗ实际行动影响我，坚持艰苦朴素，勤俭自强，实实在在做人做事，踏踏实实求学创新的原则。在此，衷也感谢我的导师程天印教授两年来给我的关也和指导。本论文的采样阶段是在衡阳地区地区的衡阳县、衡南县、祁东县、来阳市、常宁市、衡山县、衡东县的２８个乡镇进行的。在此，我要特别感谢衡南县的刘交良、刘盛良两位前辈，因为在当地只有在很偏僻的乡镇才放养山羊，他们在百忙之中步行２０多里到达当地的山羊养殖基地。两位前辈在采集山羊身上婢虫时一，传授抓婢虫的技巧直无私的分享他们几十年的饲养山羊的经验，Ｗ及婢虫的生活习性，在此，我向两位辛勤的农民伯伯献上我崇高的敬意。实验过程中得到几位学长的指导和帮助，徐兴莉师姐、严芬师姐和杨亚师姐一从显微镜观察到ＰＣＲ切胶、跑胶、克隆等每个细节都是从头教起，认真、细致，。同时唐吴、廖正慧、周宇駿、伏健等同学在我不暇时给予帮助。感谢湖南农业大学动物医学院预防实验室的屈泰龙师兄、葛猛师兄、刘晓波同学、杨涛涛同学、危冰玉同学、王先坤同学、胡玉立同学、吴海超同学、赵壞同学、罗璋同学、杨宇同学、李海锦同学、陈荣华同学、李晓文同学在撰写论文时给予的指导。一特别感谢我的爸爸妈妈，他们在我读研究生苦恼无助的时候直默默的支持，。关也我，没爸爸妈妈默默无私的付出我不可能取得今天的成就正是因为他们一直Ｗ来的支持和无微不至的关爱，我才能顺利完成研究生学业。刘瑞昆２０１５年４月３９ 湖南农业大学硕上－学位论文作者简介基本情况说明：作者姓名：刘瑞昆性别：男出生年月：１９９０年５月１７日籍贯：湖南衡阳专业：预防兽医学研究方向：兽医寄生虫教育经历：？２００８／０９２０１２／０６在湖南农业大学动物医学院０８级本科动物医学创新班学习。￣２０１３／０９２０１５／０６在湖南农业大学动物医学院预防兽医系预防分子试验室学习。４０