人乙醇脱氢酶原核表达载体构建及产物活性测定

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1、人乙醇脱氢酶原核表达载体构建及产物活性测定：钱晓伟，潘丹岷，谭湘陵【摘要】目的：构建人乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)原核表达载体，在表达菌BL21中进行体外原核表达并测定ADH蛋白的酶学性质。方法：用RT-PCR技术从人肝RNA中克隆ADH开放阅读框架序列，并与表达载体pET-5a连接、转化入宿主菌BL21中，并经培养、筛选、酶切和测序鉴定。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达菌并测定表达蛋白的酶学参数。结果：原核表达载体pET-5a-ADH构建成功；表达蛋白分子量在40kD左右；酶学测定表明表

2、达蛋白是一种耐酸、耐高温的脱氢酶，钾离子和三价铁离子对其酶活性有促进作用，二价金属离子对其活性有抑制作用。结论：人ADH原核表达载体pET-5a-ADH成功构建，原核表达产物具有一定的ADH蛋白活性。该研究为进一步了解ADH酶学性质，探讨酶活性多态性与疾病的关系打下基础。【关键词】乙醇脱氢酶；原核表达；酶活性；人[Abstract]Objective:Toconstructtheprokaryoticexpressionvectorofthehumanalcoholdehydrogenase(ADH),gettheprokaryoticpr

3、oductinvivo,anddetectitsenzymicproperty.Methods:Thesequenceofopenreadingframe(ORF)ofhumanADHhumanliverRNA.ThenitedintohostbacteriumofBL21.Then,culturing,screening,cuttingbyrestrictionenzymeandsequencingedforidentification.IPTGeenzymicindexesofexpressedproteinsolecularperat

4、ureenvironment.K+andFe3+hadastimulativeeffectonenzymicactivity,butdivalentmetalionhadarestraineffect.Conclusions:ThehumanADHprokaryoticexpressionvectorissuccessfullyconstructed,andtheADHproteinfromprokaryoticexpressionhasactivity.Thepresentstudyprovidesexperimentaldatatoun

5、derstandADHenzymicproperty,andtoexploretherelationshipbetorphismofADHactivityanddisease.[Keyeactivity;Human乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)是乙醇代谢中的关键酶。ADH催化乙醇转化为乙醛，然后ALDH把乙醛转化为乙酸，乙酸又经三羧酸循环途径，最终转化为二氧化碳和水排出体外。研究发现，ADH和ALDH都是多个同工酶组成的大家族。人类ADH基因

6、位于4q21-25，可编码同源或异源二聚体的ADH同工酶。目前已发现了7种亚型，分别为ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7，这些基因在人群中存在着广泛的多态性[1]。ADH是一种含锌的金属酶，其同工酶有20余种，常见ADH的亚基类型有5种，分别为α、β、χ、γ和π[2]。由于ADH存在着多态现象，因此乙醇代谢能力在人群中也存在着差异，不仅如此，ADH的多态性也与器官病变和疾病发生(如肝硬化、心脏病等)的易感性也相关[3]，甚至与乙醇依赖性也相关。为进一步了解ADH的酶学性质，探讨ADH与疾病的关系，本文

7、构建了人ADH原核表达载体，进行了体外表达，并测定了部分酶学参数。1材料和方法1.1材料与试剂人肝脏标本来自于肝癌患者手术切除的癌旁正常组织。Trizol、逆转录试剂盒、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶等购自TaKaRa公司，NAD+氧化型辅酶Ⅰ购自上海捷瑞公司。1.2方法1.2.1原核表达载体pET-5a-ADH的构建根据Trizol说明书提取人肝总RNA，并逆转录形成cDNA。根据人ADH(GenBank登录号：AF153821)序列和原核表达载体pET-5a多克隆位点的内切酶分布，设计了一对带有BamHI和EcoRI酶切位点引物，引物

8、序列分别为：5'-CGGGATCCATGAGCACAGCAGGAAAAGTA；5'-CGGAATTCGCATCTCTATTGCCTCAAAAC(下划线部分为酶切位点)。根据上述引