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时间:2018-07-23
《人dna修复基因hogg真核表达载体的构建及序列测定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定作者:魏永长,南克俊,惠凌云,贺大林【关键词】遗传载体;HOGG1基因;克隆,分子;DNA修复ConstructionandsequencingofeukaryoticexpressionvectorofhumanDNAbaseexcisionrepairgeneHOGG1【Abstract】 AIM:ToclonehumanDNAbaseexcisionrepairgene,8oxoguanineDNAglycosylase,andconstructitseukaryoticexpressionv
2、ectorwithsequenceanalysis.METHODS:TotalRNAwasextractedfromthelivertissueofhumanfoetusbytheguanidiniumthiocyanatemethod.ThewholeHOGG1codinggenewasamplifiedbyRTPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpCMVMyc.PlasmidDNAwasextractedandsubjectedtorestrictionenzymeanalysis.Clonesrep
3、resentingcDNAinsertsweresequenced.RESULTS:TheconstructionofeukaryoticexpressionvectorpCMVMyc/HOGG1wassuccessfulandtheresultedsequencecompletelycoincidedwiththe9/9designs.CONCLUSION:TheconstructionofeukaryoticexpressionvectorpCMVMyc/HOGG1providesanewwayforbiologicaltargetedtherap
4、yinvolvingDNAbaseexcisionrepairgeneHOGG1.【Keywords】geneticvectors;HOGG1;cloning,moleculor;DNArepair【摘要】目的:克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体,进行序列测定.方法:提取人胎肝总RNA,设计HOGG1特异性引物,通过RTPCR扩增,将HOGG1基因克隆到pCMVMyc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证.结果:获得人HOGG1基因全长,并成功构建pCMVMyc/HOGG1真核表达载体.结论:HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向治
5、疗药物的开发提供一种新的手段.【关键词】 遗传载体;HOGG1基因;克隆,分子;DNA修复 0引言细胞的有氧代谢过程及其暴露于环境诱变剂时均可产生活性氧[1-2].在患病情况下,生物的抗氧化能力有一定限度,一旦生物体内的氧化应激负荷超过抗氧化系统所承载的极限,ROS便可攻击DNA造成DNA损伤.损伤的DNA在再次复制和分裂时可形成突变.DNA突变可激活癌基因或使抑癌基因失活,从而导致细胞生长周期紊乱.9/9DNA氧化损伤产生大量的修饰碱基,其中8羟基鸟嘌呤能高度致突变性损伤.鉴于此,研究者把它用作肿瘤发生过程中氧化损伤的敏感标志物[3].HOGG1基
6、因编码的hOgg1蛋白具有DNA修复功能,参与8oxoG的切除,从而保护遗传物质不受损伤[4].我们采用基因工程的方法,从人胎肝组织中克隆人HOGG1基因,并构建其真核表达载体,以进一步研究该基因在肿瘤DNA氧化损伤修复中的作用. 1材料和方法材料Trizol;限制性内切酶EcoRI/KpnI;pCMVMyc载体试剂盒;RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶;Taq酶、DH5α感受态细菌、凝胶回收试验盒、所有寡核苷酸和引物及克隆测序均由上海申能博彩公司提供.其他试剂为通用高纯试剂.DNA扩增采用PE9600扩增仪. 方法扩增HOGG1基因取来自于意外流产
7、的100mg人胎肝组织,在液氮中研磨至粉末状,加入1mLTrizol,按产品提供的操作手册抽提总RNA.紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度,使A260nm/A280nm比值在~之间.变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下观察并拍照.在2mg总RNA中,加入DEPCH2O,使总体积为8mL,加入mLRNA酶抑制剂、2mLoligo引物、400UMMLV9/9RT逆转录合成cDNA第一链,逆转录反应为37℃1h,90℃5min,冰上冷却,室温高速离心5s.将cDNA溶液储存于-20℃备用.参考GenBank登录的HOGG1基因的cDNA序列设计扩增HOGG1全长
8、的引物.上游引物序列为F:5′AGAGAATTCGGATGCCTGCCCGCGCGCTTCTG
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