简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆与表达与初步鉴定

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1、●简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鏊定中度抑制血管内皮细胞(BEC)的增殖，而对BEC的移行无作用：K2区的抑制活性较弱：K4区具有较强的抗BEC移行的作用，而抑$【jBEC增殖作用较小“⋯；这前4个kringle环即构成了血管抑素。在对As进行氨基酸测序分析后发现：As与纤溶酶原N末端98位氨基酸残基到440位氨基酸残基内的片段有98％以上的同源性。与As由一个赖氨酸相连的kringle环K5，就足hPK一5。其分子量约为15kD，由八十多个氨基酸组成，是含3个二硫键(Cys461-Cys540，Cys482-Cys523，Cys5

2、1I--Cys535)的环状区域．K5与前4个kringle区同源性较高，分别为K1，57．5％；K2，46．3％；K3，48．8％；K4，52．5％￡15．Is]O单独的kringle5区抑制内皮细胞增殖和抗迁移能力都较强，这使得kringle5的应用价值日渐突出。1997年Cao等发现hPK．5抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的牛毛细血管内皮细胞(BCE)增长的半数有效剂量为50～60moFL，远低于As的140mol／L。并证明去除了hPK-5后，BCE的增殖能力可恢复，表明hPK-5对BCE无毒性作用。hPK．5的作用机理，非常复杂。它不仅参

3、与调节血管增生的平衡，还参与调节炎症反应“⋯，但其作用的特异性强，主要针对内皮细胞呈选择性的抑制作用，表现在抑制内皮细胞的增殖、迁移与诱导调亡“””等各个方面。而对其它细胞，如3T3成纤维细胞，人单核／巨噬细胞等无作用，且hPK-5只作用于增殖状态的内皮细胞，对正常内皮细胞或静止的内皮细胞也无作用。有研究表明K5的抗内皮细胞增殖活性主要是通过直接或间接地作用于细胞周期的调控而影响内皮细胞的细胞周期而实现的。hPK-5能使内皮细胞周期停滞，阻止内皮细胞从G-期进入S期，从而诱导细胞调亡啪1。hPK．5还可通过直接或间接对抗生长因子的刺激作用r20

4、从

5、而影响体内多方面的病理变化过程，比如对细胞周期蛋白、周期蛋白的激酶等7●◆简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鉴定的抑制。“，对bFGF诱导的内皮细胞生长的抑制，且该作用呈剂量依赖性；hPK-5还可诱导纤溶酶原的激活物，抑带IJMMPs水解蛋白活性，而MMPs对血管内皮细胞以及对肿瘤细胞生长及迁徙有抑制作用。此外，hPK一5还可通过抑制缺氧诱导因子t(H2F—1)的核定位和p42／p44有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)活性，下调血管内源性正向调控因子，但具体信号转导机理还不明确”。hPK．5蛋白还可通过抑制炎性细胞分泌细胞因子，阻止内皮

6、细胞进入细胞周期，抑制内皮细胞的增殖，从而达到抑制新生血管增生的作用“”。长期以来科学工作者们都在寻找高特异性的抑制肿瘤增殖及癌组织扩散的理想药物。hPK-5与现有抗肿瘤药物相比，它的特异性强、抑制作用明显，能有效预防肿瘤的浸润和迁移。由于hPK一5能够特异性地作用于处于增殖状态的内皮细胞，从理论上讲它对静止的内皮细胞和其他细胞无毒副作用，局部给药不会引起炎性反应，性质稳定，因此在防止肿瘤组织的扩散迁移方面优于其他药物。目前，hPK．5主要是通过基因工程重组技术获得，它的纯化比较复杂，其得率也只能满足实验室科学研究的小量需求，而且llPK．5的相对

7、分子量仍偏大。因此，我们通过研究hPK-5的功能性区域及蛋白的空间结构，删除了hPK-5的核苷酸序列的N端和c端的部分残基，保留了环状结构上的全部氨基酸，直接克隆出了简化后的hPK．5(predigestedhPK-5，predhPK-5)，并将其与GST进行融合表达，为后续的试验研究奠定了基础。●◆简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鉴定第一部分简化的hPK．5基因的克隆及融合表达质粒的构建与筛选材料与方法一、材料人肝脏组织：来源于四川大学第一附属医院。pGEX-17．T质粒、菌种JMl09均由本实验室保存。二、主要仪器1．BECKMA

8、N低温高速离心机2．台式高速离心机3．ModelMyGene25Plus型PCR仪4．DYY-5型稳压稳流电泳仪，水平电泳槽5．恒温水浴箱、恒温水浴摇床、恒温孵箱6．GDS800凝胶成像系统及图像分析软件Gelworks(UVP)7．SANYO--80"C冰箱三、主要试剂1．DEPC、琼脂糖(Agarose)、酵母提取粉、胰蛋白胨、SDS：Sigma公司。2．溶液D：称取259异硫氰酸胍，量取O．75mol／L的柠檬酸钠1．76ml，10％(m／v)月桂肌酸钠2．64ml，DEPC处理水29．3ml，配成50ml的溶液，最后再加B一巯基乙醇0．36

9、ml。4"C保存，2个月内有效。9●◆简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鍪定3．a)溶液I：50mmol／L葡