假蕈状芽孢杆菌34KD纤溶酶基因的克隆与表达

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1、河北农业大学硕士学位论文假蕈状芽孢杆菌34KD纤溶酶基因的克隆与表达姓名：郭晓军申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：朱宝成20080609摘要本论文重点研究了假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)34kD纤溶酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达，并做了一些枯草杆菌表达方面的研究。主要研究结果如下：本实验室顾从土壤中分离筛选出具有纤溶酶活性的假蕈状芽孢杆菌，且对此菌株的纤溶酶蛋白进行分离纯化，得到34kD单一活性组分，埃德曼降解法测得N端序歹0为VTGTNAVGTGKGVLG。根据此十五个氨基酸在NCBI上进行比对，

2、找到了十种100％同源蛋白序列，并根据相对应的编码序列的同源性设计了一对简并引物，并在5’端分别加入了EcoRI和XhoI的酶切位点。以产纤溶酶的菌株假蕈状芽孢杆菌的基因组DNA为模板，利用设计的引物进行PCR，获得了一个完整的两头含酶切位点的纤溶酶基因BpFE。使用砌RI和励DI双酶切载体pGEX．4T-2和BpFE基因，通过连接构建了重组质粒pGEX．BpFE，并对BpFE基因进行了测序。结果表明：此细菌纤溶酶基因全长1701bp，编码566个氨基酸。与相似性最高的序列bacillolysin(BacilluscereusH3081．97)比仅存在

3、5个氨基酸的差异，含有中性锌金属蛋白酶结构域。将重组质粒pGEX．BpFE利用热激转化法转化到大肠杆菌宿主菌BL21中，经IPTG、低温诱导后，SDS．PAGE显示胞内含有表达条带，表达产物的相对分子量大小为98kD，比预计的分子量(90kD)稍大。酪蛋白平板法和纤维蛋白板法均显示1．0mmoVLIPTG，26℃和30℃诱导5小时后的重组菌经超声波破壁后的胞内蛋白有活性。但是大肠杆菌表达系统大部分为胞内表达，这样就为生产带来了很多的不便。而枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点，被认为是表达和分泌异源蛋白的理想受体。以pUCl9．5．2为模板，通

4、过PCR方法得到含sacB基因的启动子、200bp的类似转录终止信号的序列、核糖体结合位点及编码29个氨基酸的信号序列，将此535bp序列通过酶切连接到大肠．枯草穿梭质粒pMK4上，构建了大肠杆菌．枯草芽孢杆菌诱导分泌型穿梭质粒pSK4。并将纤溶酶基因BpFE克隆到了pSK4载体上，待下一步进行枯草杆菌的分泌表达研究。本试验试图建立用基因工程的方法生产微生物纤溶酶的技术平台，以便进一步研究纤溶酶的功能、作用机理及在生命科学、医疗和保健等方面的应用潜力，为基因工程药物的开发奠定必要的理论和实践基础。关键词：假蕈状芽孢杆菌；纤溶酶；大肠杆菌；枯草杆菌；克隆

5、；表达CloningandExpressionof34KDFibrinolyticEnzymeGenesfrom&pseudomycoidesMastercandidate：Guoxiao-junMajor：BiochemistryandmolecularbiologySupervisor：Zhubao-chengAbstractWemainlystudiedthecloningoffibrinolyticenzymegenesproducedbymicroorganismanditsexpressioninE．coliandBacillussubti

6、lis．Theresultsareasfollows：GuscreenedBacilluspseudomycoideswithfibrinolytieenzymeactivityfromsoil，thenseparatedandpurifieda34kDprotein．Edmandegradationshowedthat15aminoacidsofN-terminalsequencewereVTGTNAVGTGKGVLGByusingtheprogramofBLASTonNCBIGenBankdatabase，wefoundtenproteinsequ

7、enceswith100％homology．Thendegenerateprimersweredesignedbasedonthehomologyofcodingsequence．WealsoaddedEcoRIandXhoIrestrictionsiteonbothends．UsinggenomicDNAofB．pseudomycoidesastemplate，weproformedPCRandobtainedacompletefibrinolyticenzymegene-BpFE．ThepurifiedvectorpGEX-4T-2andPCRpr

8、oductofgeneBpFEWeredigestedbyEcoRIandXhoI．ARea"