枯草芽孢杆菌Mrp系统基因的克隆与表达研究

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1、武汉理工大学硕士学位论文摘要本课题选定嗜碱菌的Mrp(multipleresistanceandpHadaptation)Na+／I-I+反向载体作为研究对象。MrpNa+／I-I+反向载体是由六至七个基因编码的膜蛋白组成的异体蛋白复合体，是分布于细胞膜上的次级转运蛋白系统，在调节嗜碱菌细胞质pH衡稳方面起关键作用。嗜碱菌膜蛋白系统介导的胞外和胞内间的Na●循环是其嗜碱适应性的重要基础，而Na+／I-1斗反向载体是Na+循环过程中的关键因素之一。其中MrpF基因编码了一种分子量15KD的膜蛋白，并且irpF与钠离子偶联转运器之间的关系及其与钠离

2、子电压门控通道之间的关系已经受到广泛关注。虽然有迹象显示MIpF具有胆酸转运活性，但是尚未有实验证据证明其介导Na+与胆酸之间的偶联转运。本研究从枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌中成功扩增了Mrp系统基因，并且构建了N端带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的表达载体，其中MrpF基因达到了异源超量表达，并用亲和层析法得到纯化。本研究涉及到基因克隆、融合表达载体的构建、融合蛋白表达与纯化与蛋白活性一系列分子生物学与基因工程的实验内容，设计如下研究方案：(1)基因克隆：获取枯草芽孢杆菌的模式菌，提取其基因组DNA分子，根据mrp操纵子的特性在目的基因的两侧设计

3、引物，所设计引物包含了合适的限制性内切酶酶切位点，通过PCR技术扩增目的基因mrpE、F、G；(2)融合表达载体的构建：用合适的限制性内切酶酶切质粒载体和扩增的目的基因产物，要求所选择的质粒载体带一个有助于目标蛋白表达与纯化标签和一个抗性标记，设计连接体系，连接酶连接，最后转化入克隆和表达宿主菌，经过筛选和酶切验证获取正确的重组质粒；(3)表达与纯化：在表达宿主菌中诱导表达重组蛋白。摸索优化表达条件，以达到异源超表达，从而获取足量的重组蛋白。亲和层析法纯化重组蛋白，进一步研究其功能和结构。，(4)蛋白活性研究：选择合适的底物，利用等温滴定微量量

4、热法研究蛋白与底物之间的相互作用关系，推测蛋白的功能活性。关键词：嗜碱菌，Nd／H+反向转运载体，Mrp系统，克隆表达，纯化武汉理工大学硕士学位论文AbstractThisissueselectedtheMrpNa+／旷antiportersinalkaliphilesbacillusformestudy．InBacillussubtilis，theMrpantiporterismembraneproteincomplexesencodedbyalloperonconsistingofmrpABCDEFGgenes．Alkaliphilesme

5、mbraneprotein-mediatedNa+effiuxintracellularandextracellularisallimportantbasisforthealkalophilicadaptation，andtheNa+／矿antiporterisoneofthekeyfactorsintheprocessofNa+effiux．ThemrpFgeneinmrpoperonisencodingamembraneproteinwithamolecularweightof15kDa．ThereareindicationsthatMrp

6、FofB．subtilisexhibitscholatetransportactivity．Inthepresentwork，weclonedthemrpFgencfromBacillussubtilisstrain168andgenerateanexpressionvectorsharbouringN-terminalMBPtaggedMrpFproteins．TheMBP—MrpFproteinwasover-expressedinEscherichiacoilstrainBL21(DE3)andpurifiedtohomogeneousb

7、yaffinitychromatography．Thisstudyinvolvedaseriesofmolecularbiologyandgeneticengineeringexperimentcontent：genecloning，fusionexpressionvectorconstruction，thefusionproteinexpressionandpurification．Wedesignedresearchprogramsasfollows：(1)Genecloning：ToobtainamodelofBacillussubtil

8、isbacteria,extractgenomicDNAmolecule．Accordingtothecharacteristicsofmrpoper