枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽的表达综述

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1、枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽的表达综述　　由于抗生素药物的滥用，出现了越来越多的抗生素耐药菌株，传统抗生素替代药物的开发已成为目前研究热点。在生物机体中分离出的抗菌肽被认为是一种最有潜力的抗菌类药物。抗菌肽一般含有10~50个氨基酸，整体带有2~9个的正电荷，较大部分（≥30%）的疏水性氨基酸（Hancock和Sahl,2006）。抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、无毒副作用（仅少数种类具有溶血活性）、无残留与无污染等优点，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产中使用，具有作为新一代饲料添加剂的潜质（

2、单安山等，2012）。　　枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是广泛存在于土壤和动物胃肠道的一类革兰氏阳性菌，目前已作为重要的工业菌种被越来越多地应用于畜牧业生产中。枯草芽孢杆菌具有易于分离培养、较清晰的遗传背景、良好的分泌性及无致病性等优点。　　近几年来利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生菌成为热点研究领域。本文对枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽在其中的表达进行了简要的综述，以期为开发饲用型抗菌制剂提供参考。　　1枯草芽孢杆菌表达系统　　枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一类好氧型、内生抗

3、逆性孢子的革兰氏阳性菌。其细胞呈直杆状，大小为（0.8~1.2）μm（1.5~4.0）μm,广泛分布于土壤及腐败的有机物中。因其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术，故枯草芽孢杆菌是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主，是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。　　枯草芽孢杆菌具有自己独特的生长规律：生长延滞期、对数期、稳定期、衰亡期及芽孢发育期。其在不同的生长阶段基因表达不同，有多种不同时序性的σ因子来调节（Staroń等，2009）。

4、杨明明（2013）利用电转化介导枯草芽孢杆菌早期生孢基因的敲除，获得了枯草芽孢杆菌生孢基因缺失株B.subtilisGJ09.枯草芽孢杆菌表达系统的另一个特点是其能将蛋白大量分泌至培养基中，通过生物信息学预测，枯草芽孢杆菌共有294种外分泌型蛋白。但是由于其胞外蛋白酶表达量大反而容易引起目标蛋白的降解，目前通常的解决方法是采用蛋白酶缺陷株作为宿主（Nijland和Kuipers,2008）。　　虽然与大肠杆菌表达系统相比枯草芽孢杆菌表达系统更适合应用到制备饲用酶及抗菌制剂中，但是其嵌合载体拷贝数低、启动子活性低，导致目标基

5、因表达量低等问题。近几年的研究主要围绕着如何构建高拷贝的载体、筛选高活性的启动子等内容。　　1.1枯草芽孢杆菌载体系统在微生物的遗传操作中，质粒载体是基因重组技术中的重要工具。然而大部分枯草芽孢杆菌不含内源性质粒。目前常用的质粒一般于葡萄球菌和链球菌，其中应用效果较好的是采用滚环型复制的小型质粒。但是质粒仍然存在分离不稳定，结构不稳定等问题（Tanaka等，2010）。这严重影响了其在枯草芽孢杆菌的研究应用，此外在枯草芽孢杆菌的遗传操作中，体外连接的双链质粒DNA分子直接转化宿主效率极低。许多基因不能直接构建枯草芽孢杆菌质

6、粒载体，转入宿主菌进行表达。然而，大肠杆菌分子遗传操作成熟，不会产生质粒不稳定性现象，因此可以将外源基因在大肠杆菌中构建完成后再转化到枯草芽孢杆菌中表达。故构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭质粒载体是十分必要，目前常用的穿梭质粒载体有pEB10、pEB20、pEB60、pUB18、pUB19和pWB980,还有能够实现在枯草芽孢杆菌中高效表达的pHT01和pHT43（余小霞等,2015;Nguyen等,2007）。李瑞芳等（2006）用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒Pub18共整合得到双功能克隆载体pSB.杨明明（20

7、13）从质粒的大小、多克隆位点的合理布局、抗性标记的便利性、质粒提取的便利性以及复制子特性等角度出发，构建了新的结构紧凑的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ03及pGJ148.　　1.2枯草芽孢杆菌表达系统的启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。获得高活性的启动子是实现外源基因高效表达的关键。在枯草芽孢杆菌表达系统中常用的启动子主要分为2个类型：组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子即持续性表达蛋白的启动子，如P43启动子（Ch

8、iang等，2010）。这类启动子启动强度通常要求较强，且成本低，一些组成型启动子常通过构建胞内或分泌表达载体表达目的蛋白，但存在对宿主生长有害的蛋白难以表达和可控性差的缺陷（Ying等，2011）。诱导型启动子可以根据需要调控基因的表达。常用的诱导型启动子主要有4类：Pspac、Pxyl、PsacB和