枯草芽孢杆菌mrp系统基因克隆和表达的研究

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1、摘要本课题选定嗜碱菌的Mrp(multipleresistanceandpHadaptation)Na+／H+反向载体作为研究对象。MrpN—，旷反向载体是分布于细胞膜上的次级转运蛋白系统，在调节嗜碱菌细胞质pH衡稳方面起关键作用。嗜碱菌膜蛋白系统介导的细胞外和胞内间的Na+循环是其嗜碱适应性的重要基础，而Na+／I-I+反向载体是Na+循环过程中的关键因素之一。MrpNd／i-i+反向载体是存在于嗜碱菌Bacillus的反向载体系统，是由七个基因编码的膜蛋白组成的异体蛋白复合体。本研究对枯草芽孢杆菌Mrp系统基因进行克隆及表达研究，分析枯草芽孢杆菌的嗜碱机理，从而更

2、有效的将嗜碱菌应用到工业生产中。本研究分为三个部分：1．pTTQl8表达载体构建及Mrp融合蛋白的表达：本部分实验用PCR技术扩增得到mrp操纵子的主要基因mrpABC、mrpD，插入到pTTQl8质粒中，构建重组质粒pTTQl8．mrpABC，pTTQl8．mrpD并用双酶切和序列测定对重组质粒进行测定。然后以构建好的pTTQl8．mrpABC重组质粒反向PCR扩增出pTTQl8-mrpAB、pTTQl8·mrpA，同样对pTTQl8一mrpAB、pTTQl8-mrpA进行双酶切和序列测定。然后将重组质粒转入到大肠杆菌BL21中进行表达研究，并且以含有MBP蛋白基因

3、的pGJLl6质粒做表达对照。实验结果表明含有重组质粒pTTQl8一mrpABC、pTTQl8-mrpAB、pTTQl8-mrpA、pTTQl8-mrpD的BL21菌株诱导表达抽提膜蛋白跑SDS．PAGE并没有发现明显的表达，含pGJLl6质粒的对照菌株能够正常表达。2．大肠杆菌酸性磷酸酶(EcAP)作为膜蛋白表达伴侣的研究：利用大肠杆菌酸性磷酸酶(Escherichiacoliacidphosphatase，EcAP)作为表达伴侣，对膜蛋白进行了表达尝试。大肠杆菌酸性磷酸酶分布于大肠杆菌膜间隙，分子量约为48kDa，其序列、功能、结构已有多篇文献报导。本课题所选定表

4、达的目标膜蛋白为源于大肠杆菌的核苷酸转运蛋白NupC和源于枯草芽孢杆菌的MRPNa+／H+反向载体系统的MrpD亚基，其中NupC分子量为44kDa，MrpD分子量为55kDa。基于序列的拓扑学结构预测表明两种膜蛋白的N端都位于膜间隙，因此如果在N端连接表达伴侣EcAP，目标蛋白结构和功能被破坏和影响的几率较小。实验结果表明N端结合了EcAP的EcAP．NupC和EcAP．MrpD能够进行异源表达，说明EcAP能够作为表达伴侣促进膜蛋白表达。3．MBP(maltose—bindingprotein)蛋白作为膜蛋白表达伴侣的研究：本研究是基于本实验室已有的pMAL．p4

5、X质粒，构建pMAL-p4X[MBP-NupC]质粒和pMAL．p4X[MBP-MrpD]。pMAL-p4x质粒中含有MBP基因。具体步骤为，利用PCR技术将mrpD和nupC基因分别从含有相应基因的质粒扩增出来，经酶切消化后作为插入片段，插入到pMAL-p4x载体中，构建pMAL．p4X[MBP-NupC]和pMAL．p4X[MBP-MrpD】重组质粒。含有重组质粒pMAL．p4X[MBP-NupC]和pMAL．p4X[MBP-MrpD]的BL21菌株在M9培养基培养，加IPTG进行诱导表达重组膜蛋白的研究。实验结果表明N端结合了MBP的MBP—NupC和MBP．M

6、rpD能够进行异源表达，说明MBP能够作为表达伴侣促进膜蛋白表达。关键词：嗜碱菌，NaYH+反向转运载体，Mrp系统，克隆表达lIAbstractTheresearchselectsMrp—dependentN式暇antiportersofBacillusastheobject．Mrp-dependentN0暇antiportersofBacillusaresub—membranetransportproteindistributedinthecellmembrane，whichplayakeyroleinregulatingcytoplasmicpHvalue．Na

7、+cyclebetweenextracellularandintracellularwhichismediatedbyalkaliphilicbacteriamembraneproteinisanimportantbasisforalkalophilicadaptation。Na+／H—antiporterisakeyfactorintheprocessofNa+cycle．MrpN0嚼antiportersencodedbysevengeneswhichexistinthealkaliphilicbacteriaBacillusaregiantpr