环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因克隆与表达

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1、浙江大学硕士学位论文环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因克隆与表达姓名：肖竞申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：孙建义20030501摘要本研究克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因，采用表达载体pET一30a(+)Vector、DGEx．4T一3vector和宿主菌Eco，fBL21对其进行了表达，并研究了表达产物的酶学特性。主要结果如下：本试验以具有木聚糖酶活性的环状芽孢杆菌Bc(B口cf，，“scfrc“，册sBc)为出发菌株，通过对GenBank上登录的其它来源B一1，4．木聚糖酶基因序列同源性分析，根据其保守区设计了5、端引物xP51和3、端引物XP

2、31。采用TD—PCR技术克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因(己被GenBank收录，其收录号为AF490980)，该基因序列与pGEM@．Teasyvector连接，获得了重组克隆子pGEM@．TeasyBcxVector。测序结果表明，其长度为702bp，具有一个629bp的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，编码213个氨基酸的酶蛋白，其理论分子量为23．2KDa。经同源性比较发现，该环状芽孢杆菌木聚糖酶基因与GenBank上登录的其它芽孢杆菌木聚糖酶基因如AF490979(B．5曲ff，括-2)、x07723(B．cf，c“，d疗s)、

3、M36648(Bs“6，f，fs)、X59058(B口cf，，甜Jsp．)、Z34519(B．s“6，f，fJ168)、AF441773(B口cfff“Jsp．NBL420)和U51675(B口cf，，"ssp．)具很较高同源性，其核苷酸序列同源性分别为98％、96％、96％、97％．96％、92％和91％；氨基酸序列同源性分别为97％、97％、97％、97％、97％、94％和94％；经分析发现该木聚糖酶含有一个28个氨基酸的信号肽。根据表达载体多克隆位点(Mcs)和已经克隆的木聚糖酶基因开放阅读框设计了一对表达引物，其中上游引物XP525’端含有BamHI限

4、制性酶切位点，下游引物xP325’端含有XhoI限制性酶切位点。以pGEM回-TeasyBcxVcctor为模板，采用TD．PCR方法得到一条能编码木聚糖酶且两端带有限制性酶切位点的DNA片段。该片段与p0EM圆．TeasyVector连接得到亚克隆重组质粒pGEM@一TeasyBCxEvector。用BamHI和xhoI双酶切亚克隆重组质粒，回收目的片段并分别与经双酶切的表达质粒pET·30a(+)vector和pGEx_4T-3vector进行连接，将获得的重组表达质粒pET．BCXE和pGEX—BCXE分别导入Eco，fIIBL2l中，利用转化子在RBB

5、．木聚糖平板上形成的透明圈，分别筛选到含脊重缝表达质粒p嚣T．BexE秘重组表达腰粒pGEx．BCXE的阳性表达予E。co蟊BCE5和EfoffBCEl。菌株发酵活力为135．4lU／ml和123．5U糯l，分尉为浅发菌株的2．33储和2．13倍。对两秘表达系统表达豹本聚糖酶嫩物学特性磷筑显示，它嬲的最适反驻湿度均为50～60℃，在40℃以下相对稳定；最适反窿p}{均为为5，O，在pH3．O～9．0之间相对稳定，并与出发菌株的酶学特性基本～致。用SephadexG，25、Se舜adexG—lOO鞠soufce30Q等对E∞Zi8cE5嫠赫兹表达产物避季亍了分薅

6、缒傀。SDs—pAGE凝胶电泳结果显示纯化的酶蛋自分子量为20．3kDa，与成熟酶骚白的理论值相符，表明纯化的酶蛋囱为成熟木聚糖酶，同时也表明来自环状努箍抒蔻BC的本聚糖酶中确实存在28个氨基酸懿信号致序列。关键词：环状芽孢杆菌：B．1，4．木聚糖酶；核苷黢序列；克隆；表达：l司源瞧；酶特洼IllTheCloningandExpressionofXylanaseE珏eodingGenefrom露口c鲑如落C抛i妇露sBCCandidato：XiaoJingAdvisor：ProfcssorSunJianyicollegeofAn{malScience，zhej

7、i8ngUniVers时Abstr麓ctInthisstudythexylanasegeneOf占．c打懈“fd”5BCwasclonedandexpressedinlhe最c口，jBL2lbyusingpET-30a(+)andpGEX一4T*3asexpressionveetofs，thenthebioche￡niealpropertiesofexpf嚣ssiOnpfodt王etsweroa珏alyzod．mainresultsareasfbllo、Ⅳs：曰口c玎“scfrc“f口丹sBCcouldproducexylanase，anditsgenomew

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