黑曲霉产木聚糖酶及其基因xynB克隆、表达的研究

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1、黑曲霉产木聚糖酶及其基因xynB克隆、表达的研究摘要木聚糖(xylall)是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。目前，它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文以木聚糖酶为研究对象，主要分为以下几个部分：1．黑曲霉培养基的优化。通过单因素实验确定了黑曲霉(AS3．4309)液体发酵产木聚糖酶的最适培养基为：以质量分数为2％麸皮为碳源，以1％酵母膏为氮源，表面活性剂Tween80的添加量为0

2、．5％，无机盐KH2P042．6％，CaCl20．5％，MgS04．7H201％，FeS04．7H200．016％，装液量为50ml／250ml，培养的起始pH为5．0，培养温度为28℃，培养时间为72h，摇床的转速为150r／min，在此条件下，菌株产木聚糖酶活性较高，能提高至76．56U／ml，是原始菌株的1．2倍。2．双水相法纯化木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶进行纯化，确定最佳的纯化条件为：PEG4000、PEG4000浓度为19％(w／w)、K2HP04浓度为10％(w／w)、NaCl浓度为0(w／w)。在此

3、条件下，木聚糖酶的提取效果较好，K和Yt的值分别为29．34和88．67％。3．木聚糖酶酶学性质的研究。本文对黑曲霉木聚糖酶的酶学性质进行研究，结果表明：该木聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH为5．O，在40～50℃间的热稳定性较好，在pH3．0～6．0的条件范围内稳定性较好，是典型的酸性木聚糖酶；金属离子Fe2+、M92+、Zn2+对木聚糖酶活力有不同程度的促进作用，A13+对木聚糖酶稍有影响，使其活力降低；而其余的大部分金属离子对木聚糖酶的活性的影响并不大。4．基因克隆与表达。本文分别以黑曲霉基因组DNA和eDNA

4、为模板，通过PCR扩增出得到一条约为750bp，一条约为680bp的目的片段，经测序结果表明该基因全长746bp，含有68bp的内含子，基因编码区长678bp，该基因己提交GeneBank，登录号为EU423881。将测序所得正确的xynB基因与酵母分泌型表达载体pPIC9K进行连接，转化大肠杆菌DH．5a，成功构建表达载体pPIC9K--xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichm胛幻，括GSll5)，经MM／MD快慢斑进行筛选，并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培养，4～6天后，将其点于RBB．木聚糖平板上，可见

5、产生了明显的透明圈，取上清测得的酶活为160．78U／ml，是出发菌株的2．1倍。关键词：黑曲霉，木聚糖酶，发酵，基因克隆StudyonthexylanasefromAspergillusnigerandcloning，expressionofxynBgeneAbstractXylanisapoly—fivecarbonsugarandisanimportantcomponentofplanthemicelluloses，whichaccountsforone-thirdofthetotalplantcarbohydrat

6、es．Innature，Xylanisthesecondrichrenewablebiologicalresourcesjustafterthecellulose．XylanaseisakindofenzymescollectivelywhichcandegradexylanintoXylooligosaccharidesandxylose．XylanaseCandegradexylanintooligoxylose，xyloseandasmallnumberofsingle-glucose．Xylanasehasawid

7、erangeofapplicationsonfeed，paper,food，pharmaceuticalandenergyindustries．Xylanaseisstudiedinthispaper，itisdividedintothefollowingparts：1．Aspergillusnigermediumoptimization．ThesinglefactorexperimentidentifiedAspergillusniger(AS3．4309)liquidfermentationofxylanaseopti

8、mumfermentationmediumfor：usequalityscoresof2％branasacarbonsource，withl％yeastextractasnitrogensource，surfactantTween80isadded0．5％，晰th2．6％inorganicsaltKH2