碱性造纸废液微生物木聚糖酶的基因克隆 表达及相关性质研究

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1、Secrecy：NO．-ChineseAcademyofAgriculturalSciencesMasterDissertationGeneCloning，ExpressionandCharacterizationofMicrobailXylanasesfromAlkalinePaperWastewaterMs．Candidate：ZhaoYanyuAdvisor：YangPeilongMajor：BiochemistryandMolecularBiologySpecialty：MicrobialGeneEngineeringChineseAcademyofAgriculturalSci

2、encesJune2011独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：赵乜函时间汐f／年乡月f7日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：．中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文

3、。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文作者签名：趑绝t羁时间：驴ff年／月，7E1导师签名：鼢≈时间：劲If年6月f7日中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目碱性造纸废液环境微生物木聚糖酶的基因克隆、表达及其性质研究生物化学微生物基因论文作者赵艳雨专业研究方向与分子生物工程指导教师杨培龙培养单位(研究所)饲料研究所硕(博)球姓名职称单位专业签名导师＼评教授级硕导口中国食品发酵工业研究所酶工程王璋高工博导团阅中国农业科学院生物化学与硕导团人张伟副研究员博导口生物技术研究所分子生物学笈口

4、辩硕导口中国科学院主邢建民研究员微生物工程翻扒博导团过程工程研究所研究员硕导口中国科学院微生物工程帆席邢建民博导团过程工程研究所陈茹梅研究员硕导回中国农业科学院生物化学与练搠博导口生物技术研究所分子生物学研究员分子生物学锄姣口硕导口中国农业科学院张志芳博导团生物技术研究所辩教授级硕导口王璋高工中国食品发酵工业研究所酶工程珈苜博导团J委硕导团中国农业科学院农业资源农业微生物乃趔顾金刚副研究员博导口与农业区划研究所资源贝硕导口博导口硕导口博导口会议记录(秘书)孟昆论文答辩时间地点2011年6月15日8：30am饲料研究所三楼会议室捅要植物细胞肇半纤维素中最具代表性的组分为木聚糖，其可被木聚糖

5、酶水解为低聚木糖和木糖。木聚糖酶在饲料、纸浆造纸、食品、能源及环境科学等方面有着广阔的应用前景。而碱性木聚糖酶特有的高pn耐受性，使其在基因工程和工业应用，特别是造纸生产中，有着重要的理论和实用价值。碱性环境中蕴含大量新颖的未培养微生物及可培养未开发的微生物，为新型酶制剂的开发提供了宝贵的材料。本论文以采自造纸厂的碱性工业废水及活性污泥为实验材料，采用两种途径获取木聚糖酶资源。一是从环境基冈组中直接进行木聚糖酶基因的克隆表达，以开发未培养微生物中木聚糖酶基冈资源。另一方面采用富集培养的方法从此环境中分离微生物，并对可培养微生物中木聚糖酶基因进行研究。根据木聚糖酶催化保守区设计简并引物，利

6、用Touchdown．PCR等技术，直接以碱性的造纸废液环境基因组DNA为模板，克隆得到22个木聚糖酶基因片段，进一步通过Tail．PCR方法获得8个完整的术聚糖酶基因，它们的命名及与已知核苷酸序列的一致性为aw$．2x(64％)、aws．3x(52％)、aws-4x(43％)、aw$一5x(63％)、aw$一6x(48％)、xyn一9(71％)、xyn-11(69％)、xyn—b39(86％)，它们中大多数与已知基因序列一致性较低，具有较好的新颖性。对其中4个基因aws．2x，aws-4x、aws．5x、xyn．b39进行大肠杆菌异源表达及酶学性质研究，重组蛋白AWS一2X、AWS-4

7、X、AWS一5X、XYN．B39在碱性条件下均表现出较好的耐受性，而在极酸性条件下却没有活性。在pI-I9．0下，AWS．2X可以保持最大活性的50％以上，AwS_4x可以保持30％以上，AWS．5X可以达到70％以上，XYN—B39可以保持80％以上的活性，甚至在pH10．0还可以保持40％的活性，而它们在pH5．0以下均没有活性。此外，每一个酶具有较为独特的性质。AWS．2X对于硬木木聚糖的特异性远高于其它来源木聚糖，对于榉木木