欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:36809378
大小:4.25 MB
页数:75页
时间:2019-05-15
《黑曲霉产木聚糖酶及其基因xynB克隆、表达的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、黑曲霉产木聚糖酶及其基因xynB克隆、表达的研究摘要木聚糖(xylall)是一种多聚五碳糖,是植物半纤维素的重要组分,是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。目前,它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。本论文以木聚糖酶为研究对象,主要分为以下几个部分:1.黑曲霉培养基的优化。通过单因素实验确定了黑曲霉(AS3.4309)液体发酵产木聚糖酶的最适培养基为:以质量分数为2%麸皮为碳源,以1%酵母膏为氮源,表面活性剂Tween80的添加量为0
2、.5%,无机盐KH2P042.6%,CaCl20.5%,MgS04.7H201%,FeS04.7H200.016%,装液量为50ml/250ml,培养的起始pH为5.0,培养温度为28℃,培养时间为72h,摇床的转速为150r/min,在此条件下,菌株产木聚糖酶活性较高,能提高至76.56U/ml,是原始菌株的1.2倍。2.双水相法纯化木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶进行纯化,确定最佳的纯化条件为:PEG4000、PEG4000浓度为19%(w/w)、K2HP04浓度为10%(w/w)、NaCl浓度为0(w/w)。在此
3、条件下,木聚糖酶的提取效果较好,K和Yt的值分别为29.34和88.67%。3.木聚糖酶酶学性质的研究。本文对黑曲霉木聚糖酶的酶学性质进行研究,结果表明:该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适pH为5.O,在40~50℃间的热稳定性较好,在pH3.0~6.0的条件范围内稳定性较好,是典型的酸性木聚糖酶;金属离子Fe2+、M92+、Zn2+对木聚糖酶活力有不同程度的促进作用,A13+对木聚糖酶稍有影响,使其活力降低;而其余的大部分金属离子对木聚糖酶的活性的影响并不大。4.基因克隆与表达。本文分别以黑曲霉基因组DNA和eDNA
4、为模板,通过PCR扩增出得到一条约为750bp,一条约为680bp的目的片段,经测序结果表明该基因全长746bp,含有68bp的内含子,基因编码区长678bp,该基因己提交GeneBank,登录号为EU423881。将测序所得正确的xynB基因与酵母分泌型表达载体pPIC9K进行连接,转化大肠杆菌DH.5a,成功构建表达载体pPIC9K--xynB。后用电击转化法将重组质粒转化毕赤酵母(Pichm胛幻,括GSll5),经MM/MD快慢斑进行筛选,并挑取数个慢斑进行甲醇诱导培养,4~6天后,将其点于RBB.木聚糖平板上,可见
5、产生了明显的透明圈,取上清测得的酶活为160.78U/ml,是出发菌株的2.1倍。关键词:黑曲霉,木聚糖酶,发酵,基因克隆StudyonthexylanasefromAspergillusnigerandcloning,expressionofxynBgeneAbstractXylanisapoly—fivecarbonsugarandisanimportantcomponentofplanthemicelluloses,whichaccountsforone-thirdofthetotalplantcarbohydrat
6、es.Innature,Xylanisthesecondrichrenewablebiologicalresourcesjustafterthecellulose.XylanaseisakindofenzymescollectivelywhichcandegradexylanintoXylooligosaccharidesandxylose.XylanaseCandegradexylanintooligoxylose,xyloseandasmallnumberofsingle-glucose.Xylanasehasawid
7、erangeofapplicationsonfeed,paper,food,pharmaceuticalandenergyindustries.Xylanaseisstudiedinthispaper,itisdividedintothefollowingparts:1.Aspergillusnigermediumoptimization.ThesinglefactorexperimentidentifiedAspergillusniger(AS3.4309)liquidfermentationofxylanaseopti
8、mumfermentationmediumfor:usequalityscoresof2%branasacarbonsource,withl%yeastextractasnitrogensource,surfactantTween80isadded0.5%,晰th2.6%inorganicsaltKH2
此文档下载收益归作者所有