β-甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究

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1、天津大学硕士学位论文β-甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究姓名：武伟娜申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：齐崴20080501中文摘要D．甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶，可应用于食品、医药、饲料、采油等许多领域。本文以B．甘露聚糖酶的分子生物学研究为核心，利用基因工程和代谢工程的方法开展工作，主要结论如下：菌株鉴定：综合运用形态观察、生理生化实验及16SrDNA序列分析的方法鉴定了实验室保藏的产p．甘露聚糖酶菌株的属种，结果表明：该菌株为枯草芽孢杆菌，并命名为肋f甜，螂s“6f玎括TJ一200603。序列信息：利用简并PCR的方法确

2、定了肋c讲螂s甜6f玎括TJ-200603p一甘露聚糖酶的保守序列，与砌c讲螂s“6脚括G1(DQ309335)具有高达98％的同源性，再经同源PCR最终确定了p．甘露聚糖酶的完整序列，在线工具预测表明：ORF包含1104bp，编码367个氨基酸，前31个氨基酸为信号肽，后面336个氨基酸为p．甘露聚糖酶成熟肽，蛋白分子量为38l①a，等电点为5．6。氨基酸序列分析表明：肋c讲淞s“6脚括TJ。200603甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族26。目前，D一甘露聚糖酶序列已在向GenBank库提交中。大肠杆菌中的克隆、表达：成功构建了重组克隆质粒pMm_man，实现

3、了在E∞，fDH5a中的克隆；成功构建了重组表达质粒pET-22b．man，实现了在EcDZfBL2l(DE3)中的诱导表达。SDS．PAGE表明：表达的重组蛋白分子量约为38．005kDa，与预测值基本一致。蛋白主要集中在周质空间和胞内，含量分别为36．03¨g／mL和97．02嵋／mL，酶活分别为4．8U／mL和6．7U／mL。代谢通量分析：建立了大肠杆菌基因工程菌的代谢网络，利用代谢通量分析的方法，对大肠杆菌工程菌产甘露聚糖酶的代谢途径进行了分析，并对其中5个重要节点做了详细讨论。热稳定性研究：基于已获知的B．甘露聚糖酶一级序列及同源模建得到的酶蛋白高

4、级结构，并利用羟基可与酶活性位点形成氢键而稳定高级结构的结论，筛选酶蛋白的多羟基保护剂。山梨醇(29／L)、蔗糖(29／L)、壳聚糖(29几)使p-甘露聚糖酶的相对酶活分别达到222．8％、201．3％、198．7％；山梨醇(2班)、壳聚糖(1g／L)、蔗糖(39／L)的复合保护剂使p．甘露聚糖酶的相对酶活达到最高，为258．1％；p甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的50℃提高到60℃，65℃下失活速率常数ki懈减小、半衰期tl陀延长，均表明了保护剂对p一甘露聚糖酶的稳定作用。关键词：p一甘露聚糖酶，16srDNA，序列，大肠杆菌，基因克隆，表达，代谢通量分析

5、，热稳定性ABSTRACTp—mannanaseisanimportanthemicellulase，whichmaybewidelyusedinfood，medicine，feedandoilindus缸y．Inmisthesis，p-mannanasemolecularbiologywast11ecoreoftheresearCh．Thesmdywasca仃iedoutaccordingtogeneengineeringandmetabolicengineeringmethods．Themainconclusionspresentedinthiswork

6、wereshownasfbllows：Producingstrainidentification：ThestrainpreserVedbyourlaborato呵wasidentmedaccordingtot11emo印hological，physjological，biochemicalcharacte“sticsandsequencingof16Sr【)NA．TheresuItshowedthatthestrainwas肋c埘i心s“6掰括，named．鼬c川甜ss材6f甜西TJ．200603．Sequenceinfornlation：Theconsen

7、，ativep—mannanasesequenceofZ沏c肼螂J动川括”一200603wasob面nedbydegeneratePCR．Ithad98％nucleotidehomologywithB口c以螂J甜6，甜括Gl(DQ309335)．ThenthewholesequencewasobtainedbyhomologousPCR．Analysis卸dpredictionusingon—linetoolsshowedthatORFincluded1l04bp；367aminoacidswerecoded；thefirst3l锄inoacidstrans

8、latedt0signalpeptide；there