里氏木霉RUT-C30β-甘露聚糖酶的诱导表达及其cDNA的克隆

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1、内蒙古农业大学硕士学位论文里氏木霉RUT—C30β—甘露聚糖酶的诱导表达及其cDNA的克隆姓名：高宏斌申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：王和平2003.5.1摘要在里氏木霉RutC一30的基础培养基(Mandels营养液)中加入固定碳源乳糖和槐豆胶，然后将可变碳源(云杉纤维、玉米芯纤维、麦杆纤维、麦杆木聚糖、玉米芯木聚糖、云杉甘露聚糖)进行单因子、双因子、三因子、四因子、五因子的里氏木霉RutC一30正交培养实验，并以槐豆胶为底物用3，5二硝基水杨酸法测定培养液中B一甘露聚糖酶的活力。从而确定

2、了酶活最高且菌体生长良好的含云杉纤维、麦杆木聚糖和云杉甘露聚糖的诱导培养基为最佳培养基，用该培养基培养的里氏木霉(■reesei)RutC．30使其转录的B一甘露聚糖酶(B—l，4-mannanmannohydrolaseEC3．2．1．78)mRNA量能够满足RT—PCR的要求。分取诱导培养液中的菌体，用异硫氰酸胍法提取总RNA，总RNA再经无RNA酶的DNA酶处理后用于RT—PCR。在PCR扩增目的基因时，通过优选扩增体系，使镁离子浓度为】．25rr山l时RT—PCR可顺利地获得目的基因，并能定向克

3、隆到载体pGEM一3Z(amp7)中。用克隆载体转化宿主大肠杆菌JMl09，通过筛选获取阳性克隆子，对阳性克隆子进行酶切与PCR鉴定，并对载体中插入的目的基因进行测序。其测序结果与genbank中的里氏木霉RutC．30B一甘露聚糖酶成熟肽eDNA序列进行序列同源性比较，结果二者序列完全一致。关键词：罩氏木霉RutC．30、B一甘露聚糖酶、cPNA克隆TheInducementExpressionoftheB—1TlannanasefromTrichodermareeseiRUT-C30andeDNAC

4、loningof[3--mannanaseAhstractTllisexperimentpassingtogropeforthecarbonsourceconstitutesoftheculturemediumandusingZReeseiRutC-30inducedtheexpressionofB—I'ilanllml3asefB一1,4-MannanmarmohydrotaseEC3．2．1．78)．InthisexperinlenlIputtheconstantcarbonsource(1acto

5、seandlocustbeangum)inthefoundationculturemedium0vlandelsnourishmentliquid)ofZReeseiRutC-30，thenproceededthevariablecarbonsource(&agonsprucefiber,cornrushpithfiber,wheatst／'awfiber,wheatstrawxylan,C01TIrushpithxylan,dragonsprucemaunan)tosinglefactor,doubl

6、efactor,threefactor,fourfactorandfivefactororthogonalexperkment．Ideterminedtheactivi乜,ofB-iTlaDDanaseusinglocostbeangumassubstractbythe3，5-dinitosalicyfieacidmethod,andobservedthegrowingsituationofthegerm。AttheendIselectedthedirectionsf-ort}1einducemente

7、xpressionoft11eB—mannana3efromTrichOdermareeseiRut·C30thatcontainedthedragonsp／xlcefiber,wheatstrawxylan，dragonsprucemallAlan．111etotalRNAwaspurifiedfromthegermintheliquidbytheguanidineisothiocyamehodmethod,thenthetotalRNAdigestedbyDNasethathadnotRNasewa

8、susedforRT—PCR．IchangethemagnesiumiondencityinthePCRsysteminordertooptimizethePCRcondition．AttheendIselectedthemagnesiumiondensityas1．25mM．n拉productionofRT-PCRwasinserteddirecfionaUyintopGEM--3Z(amp‘)．nle!N3EM--3Z(鲫lpT)was