产内切葡聚糖酶芽孢杆菌c36筛选与基因克隆、序列分析

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1、四川农业大学生物化学与分子生物学专业2003级硕士研究生学位论文产内切葡聚糖酶芽孢杆菌C-36筛选及基因克隆、序列分析摘要以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，从废泥浆中经反复筛选及刚果红鉴定，获得一株高活力产内切葡聚糖酶芽孢杆菌。经研究发现，在培养20h后，显微镜下，经革兰氏染色为阳性。细胞杆状，细胞大小(2．2～3．0)umX(O．8～O．9)um，有芽孢，中生或近中央生，芽孢大小(1．1～1．4)umX(O．8'---'0．9)uln，卵圆形或柱形，孢囊不膨大。细胞成对或成链，具圆端，运动性较强。将此菌株C．36与枯草芽孢杆菌标准菌株ZW-1进行了参比试验，初步鉴定该细菌为枯草芽孢杆菌。在

2、CMC-Na平板上菌落呈乳白色，粘稠厚重，湿润光亮，生长迅速，24h可见明显透明圈。生长条件的测定显示该菌生长pH范围较宽，在pH7．0生长最好，在pH8．0"-～9．0的碱性条件下长势较好。摇瓶发酵粗酶液的性质测定表明，该菌所产生的内切酶在pH6．8左右酶活最高，酶活力为79．2U／mL。在pH9．0时仍能保持最高酶活力的65％以上。酶反应的适宜温度为50。C，适宜中性至碱性。根据国际基因库(GenBank)中注册的内切葡聚糖酶基因序列设计了引物，通过对内切葡聚糖酶基因PCR扩增反应条件的优化，获得了一条长约1．5kb的特异性PCR扩增条带，并对其进行了菌落PCR鉴定。然后将PCR扩

3、增片断克隆到pMDl8．T质粒中，构建含有目的基因片断的克隆质粒，并转化到JMl09株大肠杆菌载体中，筛选获得阳性克隆菌株。克隆质粒中外源片断的DNA序列测定表明，该片断含有内切葡聚糖酶基因的完整序列，内切葡聚糖酶基因全长1500bp，编码499个氨基酸。将B．subtilisC一36内切葡聚糖酶基因序列在GenBank中登陆，登陆号为DQ782954。枯草芽孢杆菌C．36与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(序列号为：Z29076．1，X04689．1，AY044252．1，X67044．1，AY766381．1)的同源性高达90％～93％，编码的氨基酸序列(序列号为：CAA82317，C

4、AA97610，AAK94871，AAZ22322，AAN07019)同源性高达90％～98％。利用在线生物信息学数据库及生物软件对本基因进行信号肽序列、N一端糖基化位点、密码子的偏爱性等分析，并对其二级结构和三维结构进行了预测。关键词枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因克隆序列分析II四川农业大学生物化学与分子生物学专业2003级硕士研究生学位论文Screeningendoglucanase—producingBucillusC一36andCloning，SequenceAnalysisofitsgene一AbstractOnestrainofendoglucanase-producingB

5、ucilluswhichcandegradesodiumcarbox—ymethylceUulosewasisolatedontheselectedmediumusingCMC-Naasonlycarbonsourcefromthemud．ThestrainhadhighceUulaseproducingabilityprovedbythecongoreddyingmethodonthecultureplates．C一36isGrampositiveafteritwasculturedtwentyhoursunderthemicroscope．Theyoungcellismostdou

6、blegroworchainshape．Thecellisstraightnotbend，(2．2～3．0)umlongand(0．8～O．9)umtall．ThecellandCallformmiddle，closermiddlespore．Thesporeisegg—round，(1．1～1．4)urnlongand(O．8～O．9)umtall，doesn’tmakesporangiambig．InCMC—Naplate，thecoloniesareivory，denseandmass，wetandbright，growrapidly，callseedistinctlytrans

7、parentcircleafter24h．ItisidentifiedasBacillussubiliusaccordingtoitsmorphological，physiologicalandbiochemiscalcharacteristics．ItisrevealedbytheexperimentsthatC一36growsinabroadrangeofpH．,whiletheoptimumpHforitsgrowingispH7．0，a