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时间:2019-02-01
《产内切葡聚糖酶芽孢杆菌c36筛选与基因克隆、序列分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、四川农业大学生物化学与分子生物学专业2003级硕士研究生学位论文产内切葡聚糖酶芽孢杆菌C-36筛选及基因克隆、序列分析摘要以羧甲基纤维素钠为唯一碳源,从废泥浆中经反复筛选及刚果红鉴定,获得一株高活力产内切葡聚糖酶芽孢杆菌。经研究发现,在培养20h后,显微镜下,经革兰氏染色为阳性。细胞杆状,细胞大小(2.2~3.0)umX(O.8~O.9)um,有芽孢,中生或近中央生,芽孢大小(1.1~1.4)umX(O.8'---'0.9)uln,卵圆形或柱形,孢囊不膨大。细胞成对或成链,具圆端,运动性较强。将此菌株C.36与枯草芽孢杆菌标准菌株ZW-1进行了参比试验,初步鉴定该细菌为枯草芽孢杆菌。在
2、CMC-Na平板上菌落呈乳白色,粘稠厚重,湿润光亮,生长迅速,24h可见明显透明圈。生长条件的测定显示该菌生长pH范围较宽,在pH7.0生长最好,在pH8.0"-~9.0的碱性条件下长势较好。摇瓶发酵粗酶液的性质测定表明,该菌所产生的内切酶在pH6.8左右酶活最高,酶活力为79.2U/mL。在pH9.0时仍能保持最高酶活力的65%以上。酶反应的适宜温度为50。C,适宜中性至碱性。根据国际基因库(GenBank)中注册的内切葡聚糖酶基因序列设计了引物,通过对内切葡聚糖酶基因PCR扩增反应条件的优化,获得了一条长约1.5kb的特异性PCR扩增条带,并对其进行了菌落PCR鉴定。然后将PCR扩
3、增片断克隆到pMDl8.T质粒中,构建含有目的基因片断的克隆质粒,并转化到JMl09株大肠杆菌载体中,筛选获得阳性克隆菌株。克隆质粒中外源片断的DNA序列测定表明,该片断含有内切葡聚糖酶基因的完整序列,内切葡聚糖酶基因全长1500bp,编码499个氨基酸。将B.subtilisC一36内切葡聚糖酶基因序列在GenBank中登陆,登陆号为DQ782954。枯草芽孢杆菌C.36与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(序列号为:Z29076.1,X04689.1,AY044252.1,X67044.1,AY766381.1)的同源性高达90%~93%,编码的氨基酸序列(序列号为:CAA82317,C
4、AA97610,AAK94871,AAZ22322,AAN07019)同源性高达90%~98%。利用在线生物信息学数据库及生物软件对本基因进行信号肽序列、N一端糖基化位点、密码子的偏爱性等分析,并对其二级结构和三维结构进行了预测。关键词枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因克隆序列分析II四川农业大学生物化学与分子生物学专业2003级硕士研究生学位论文Screeningendoglucanase—producingBucillusC一36andCloning,SequenceAnalysisofitsgene一AbstractOnestrainofendoglucanase-producingB
5、ucilluswhichcandegradesodiumcarbox—ymethylceUulosewasisolatedontheselectedmediumusingCMC-Naasonlycarbonsourcefromthemud.ThestrainhadhighceUulaseproducingabilityprovedbythecongoreddyingmethodonthecultureplates.C一36isGrampositiveafteritwasculturedtwentyhoursunderthemicroscope.Theyoungcellismostdou
6、blegroworchainshape.Thecellisstraightnotbend,(2.2~3.0)umlongand(0.8~O.9)umtall.ThecellandCallformmiddle,closermiddlespore.Thesporeisegg—round,(1.1~1.4)urnlongand(O.8~O.9)umtall,doesn’tmakesporangiambig.InCMC—Naplate,thecoloniesareivory,denseandmass,wetandbright,growrapidly,callseedistinctlytrans
7、parentcircleafter24h.ItisidentifiedasBacillussubiliusaccordingtoitsmorphological,physiologicalandbiochemiscalcharacteristics.ItisrevealedbytheexperimentsthatC一36growsinabroadrangeofpH.,whiletheoptimumpHforitsgrowingispH7.0,a
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