产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定

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1、2011届本科毕业论文（设计）产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定姓名：___________系别：__生命科学学院____专业：___生物技术10-1___学号：____100914051_____指导教师：___________2012年10月31日产淀粉酶芽孢杆菌的筛选1实验意义从环境中采集样品并从中分离纯化出能产生淀粉酶的芽孢杆菌，用于后期发酵。2实验器材2.1土样:实验前三天在土壤5-8cm处埋馒头，实验前一天2.2培养基的配方：筛选培养基:淀粉10.0g，酵母膏2.50g，蛋白胨5g，Na2HPO42.50g，MgSO4·7H2

2、O0.05g，NaCl0.05g，琼脂10.0g，水500mL，pH7.0－7.42.3器材：40个培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台2.4试剂2.4.1淀粉酶活力测定：碘液2.4.2革兰氏染色：卢戈氏碘液、95%乙醇、香柏油、乙醇乙醚3实验步骤3.1培养基的制备及其仪器的灭菌3.1.1量取500ml水，按培养基配方比例依次准确地称取淀粉（先将淀粉用水搅成糊状）、酵母膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化，不行搅拌，最

3、后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶内，加塞包扎。3.1.2试管中倒培养基约3ml，再和剩余培养基、平板、移液管用报纸包扎好，于121℃，30分钟高压蒸汽灭菌。3.1.3倒平板将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，约10ml，静置待用。4.1产淀粉酶菌株的分离、纯化41.1采集土壤样本：用塑料袋在预处理处取样4.1.2稀释称取土样5g，放入盛有45ml无菌水三角瓶中，使土样和水充分混合加玻璃珠，摇约10分钟，制成土壤悬浮液。然后将菌悬液置于

4、80℃水浴锅中，20min。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的土壤溶液，分别编号为1、2、3、4、5。4.2.1初步筛选4.2.1.1用稀释样品的不同吸管分别依次从10-5、10-4、10-3样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上（每个梯度重复两次），用涂布棒涂抹均匀。记好编号。倒置于37℃温箱中培养24小时。4.2.1.2培养24小时后，取出平板，挑取6株菌落（对光观察菌落旁有小透明圈或表面光滑的

5、菌落），分别为1、2、3、4、5、6，进行三区划线培养24h。再在挑取菌落的旁边注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。记下菌株号1、2、3、4、6。观察透明圈一号菌株最大。4.3.1分离纯化在划线的平板中挑取形态大小相似的菌落，进行斜面划线培养24h，并保存。4.3.2挑取斜面上的菌落，点种到平板中，一平板中接3种不同编号的（，大小尽量一致，写上相应的编号），123号于一个平板，146于一个平板中，分别接3次，培养24h，48h、60h。4.3.3将上述不同时段平板中3

6、种不同单菌落挑取，进行卢戈碘液染色观察其形态和芽孢。4.3.3.1涂片：用牙签沾取少量菌体，涂在洗净的载玻片上4.3.3.2染色：滴一滴卢戈碘液于菌体上，染色一分钟，在水龙头下慢慢冲洗染液。4.3.33镜检：先用低倍观察，再用油镜滴加香柏油观察染色结果。菌体周围为紫色，内部有小部分无色，为芽孢。最后用乙醚乙酯擦净镜头。观察结果：24h菌体较小，基本无芽孢。48h后观察菌体形态较大，可以看清有芽孢的1和3号。60h后染色观察，菌体变大了。1和3及4号可见芽孢。4.4高活力淀粉酶菌株的筛选：每染过一次后，就在菌落的周围滴加碘液，用尺子量

7、取淀粉水解圈直径数据如下：12346124h10mm无12mm5mm无无48h无8mm14mm12mm10mm19mm60h无无17mm11mm13mm22mm数据分析：“无”可能由于接种环过热杀死了菌体；还有菌体较小基本无透明圈产生。有数据可知1号菌株生长较好，且透明圈最大。5、菌种保藏•将初步鉴定好的菌种斜面培养基试管收起，在37℃的恒温培养箱中培养。