产L-乳酸芽孢杆菌的筛选分离和鉴定

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1、产L蜉L酸芽鞄杆菌的筛选分离和鉴定项目总结研究背景：在畜禽养殖过程中使用亚剂量的抗生素可以提高畜禽的生产性能。但大面积、长期使用抗生素，畜禽产品的药物残留增加面临食品安全问题，而且导致耐药性细菌增加、蔓延，动物和人类在使用这些药物时的安全性和疗效降低。欧盟已经于2006年1月开始禁止抗生素用作畜禽饲料添加剂。益生素为“一种可以通过改善肠道微生态平衡而对动物有有利影响的活的微生物饲料添加剂。它是一种能有效补充畜禽肠道内的有益微生物，改善消化道菌群平衡。与抗生素相比而言，益生素不存在毒性、残留、耐药性和环境污染等问题，因而益牛素的研究和应用日益受到人们的重视。芽抱杆菌中一些种类能够利用葡

2、萄糖和木糖代谢产生L・乳酸，如己经发现的凝结芽孑包杆菌(Bacilluscoagulans)。如果筛选产L■乳酸的芽抱杆菌能够应用为益生菌的话，它将具有芽抱杆菌和乳酸菌两者的优点，应用前景更为广阔。因此，本研究拟从畜禽粪便筛选产L■乳酸的芽泡杆菌，并在在体外检测芽泡杆菌有利于在胃肠道生态系统生存的固有特性和竞争性排斥病原菌的效应，为将芽抱杆菌应用为畜禽益生菌打下基础。研究内容：我们小组的成员从08年的6月份开始着手产L蜉L酸芽砲杆菌的筛选。早期，我们考虑从酸菜汁中筛选产酸的芽砲杆菌。方法一:所选用的培养基为筛选培养基，其配比为:葡萄糖0.6%,酵母膏0.1%,蛋白M0.1%,MgSO

3、40.005%,CaCO30.1%,漠甲酚紫溶液3・4滴，琼脂1.5%-2.0%oPH7.2-7.4o利用漠甲酚紫遇酸会变黄的原理筛选产酸的芽抱杆菌。过程：（1）样品制备：酸菜叶+100ml无菌水，在85°C进行水浴25min,再进行梯度稀释10-2-10-8于7支试管中。（2）涂布于筛选培养基（紫色）上，观察，挑选能发生变色反应的产酸芽砲杆菌，进行划线（牛肉膏蛋口陈培养基），初步分离纯化。（3）再次划线，进一步分离纯化以期分离出单菌落。注：用酸菜汁+90ml无菌水做平行试验。结果：产生的菌落数量较少，且只有局部变成淡黄色于是在假设原材料可行的基础上，我们分析产生此结果的原因可能是原

4、材料中所含有的产酸的芽抱杆菌数量较少，所以我们在方法上作出适当的调整。我们先对酸菜汁中的细菌进行增殖，放进摇床（30°C）进行好氧培养增殖12h后提取2%・5%的菌液进行水浴25min,其余操作不变。结果：产生的菌落数量仍然比较少，且变色的范围很小由于结果不令人满意，所以我们作了新的尝试，将筛选培养基换成添加了洪甲酚紫的MRS培养基，其余步骤不变继续进行试验，结果依然不如人意，菌落数少且不均匀，变色不明显。由此说明酸菜汁中芽范杆菌数量较少，且产酸能力较差。菌落边缘整齐，有隆起，单菌落大小不一，直径大至3mm,/bS0.5mm,表面湿润，粘稠。染色呈格兰仕阳性，菌体较小，连接成杆状，有

5、芽砲，体积占菌体12,中间生或端生都有。验证实验：用乳酸菌液按上述方法进行实验，漠甲酚紫变色反应较明显，证明该方法有一定的可行性。结论：经过多次重复实验，表明实验用漠甲酚紫做指示剂，对酸度比较敏感，难以控制量化，所以用漠甲酚紫来鉴别产酸芽鞄杆菌可行性不高。而且酸菜中产酸的芽泡杆菌数量较少且产酸能力较差，不是理想的原材料。方法二由于经过多次试验的失败，证明酸菜汁不是我们理想的原材料，于是，我们尝试用新鲜猪粪和鸡粪作为原材料，并改用含CaC03的GYP筛选培养基进行试验。选用添加了CaC03的GYP培养基为筛选培养基，其配比为：葡萄糖2%,酵母膏0.5%,大豆蛋白0.5%,琼月旨1.5%

6、-2.0%,CaCO31%O利用CaCO3会与酸反应而使培养基出现透明的溶钙圈來筛选具冇产酸能力的芽抱杆菌。过程：（1）样品制备：猪粪或鸡粪+45mlGYP液体培养基，置于30。C摇床培养6~7h,在85°C进行水浴15min（将原来的25min缩短，是为了防止过度水浴而杀死芽砲杆菌），再进行梯度稀释10-2-10-8于7支试管中。（2）涂布于筛选培养基（含CaC03）上，观察，挑选能产牛溶钙圈的产酸芽泡杆菌，进行划线（牛肉膏蛋白腺培养基），初步分离纯化。（3）再次划线，进一步分离纯化以期分离出单菌落。结果：长出的菌落较少且形态各异，大小不一，连续观察数天均没有岀现溶钙圈，镜检部分有

7、芽抱于是在假设原材料可行的基础上，我们分析产生此结果的原因可能是富集的时间过长或过短，使菌种已到达衰亡期或仍处于延迟期。因此我们制备了多个样品进行摇床培养，每隔1天取出一个样品进行水浴然后梯度稀释，再涂布到筛选培养基（含CaC03）上，培养观察，挑选能产生溶钙圈的产酸芽砲杆菌。结果：不同富集时间的平板上菌落数量均较少，连续观察数天均不出现溶钙现象，但镜检发现部分有芽孑包。多次实验失败后修订新的实验方案①：10g猪粪或鸡粪+45mlGYP液体培养基振荡20m