芽孢杆菌分离筛选与培养

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1、芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm，营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁

2、中繁殖。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为45~55℃，最适为37℃。枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶冻化牛乳还原硝酸盐不产生吲哚，硫化氢V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，

3、需氧。地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。革兰氏液染色呈紫色阳性菌。细胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。1.样品：外购菌种商品微生物制剂（固体或液体）土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置PH植被情况等）。2.菌种分离与纯化2.1．培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L蛋白胨10g/L酵母膏3g/LKH2PO41.5g/LK2HPO42g/LMgSO40.1g/LPH7.4—7.6（富集用）2.1.2肉汤（NA）培养基（营

4、养琼脂）：蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4（保存计数或分离纯化用）营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖3.5g/LNaCl5g/LK2HPO40.5g/LMgSO43g/LMnSO425mg/LPH7.2—7.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌

5、株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：23★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L，酵母膏1g/L，酪素4-5g/L，K2HPO41g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.1g/L蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。另：葡萄糖0.5g/L，酪素10g/L，NaCl5g/LK2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，琼脂20g/LpH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再

6、加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。2.1.5.1.3酵母膏0.05g/L酪素4g/LKH2PO40.36g/LNa2HPO41.1g/LMgSO40.5g/LNaCl0.16g/LFeSO40.002g/LCaCl20.002g/LZnCl20.014g/LpH6.5-7.04℅酪素母液制备：4g酪素溶解于0.1N的30-35mL的氢氧化钠溶液中，水浴溶解20min，溶解完毕后加入60-70℃热水定溶到100mL.200

7、mL培养基加20mL.★★2.1.5.2脱脂奶培养基：牛肉膏3g/L（酵母浸粉5g/L）蛋白胨10g/LNaCl5g/L脱脂奶粉10-12g/L，PH7.2（用于蛋白酶产生菌的筛选）将脱脂奶（粉）加水溶解制成10℅溶液，于115℃加热灭菌20-30min，与牛膏蛋白胨固体培养基1：9混合均匀倒平板。2.1.6纤维素产生菌培养基：CMC-Na2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4（用于纤维素产生菌的筛选）2.1.7促芽胞形成培养基：土壤浸出液1000mL蛋白胨5g/L牛肉膏

8、6g/LPH7.2—7.4蛋白胨1g/L酵母膏0.7g/L葡萄糖1g/L(NH4)2SO40.2g/LMgSO40.2g/LK2HPO41g/LPH7.2—7.4（分离纯化用）产芽孢培养基：蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/L.玉米粉0.5g/L酵母膏0.1g/LPH7.2—7.42.1.8产蛋白酶发酵培养基：玉米粉30g/L豆饼粉20g/L麸皮10g/L磷酸二氢钠4g磷酸二氢钾0.3g/L碳酸钠1.0g/L　P