枯草芽孢杆菌rib操纵子表达元件修饰

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1、枯草芽孢杆菌，访操纵子表达元件的修饰Themodificationoftheexpressionelementofr／boperoninB。subtilis学科专业：生物化工研究生：陈舁指导教师：班睿副教授天津大学化工学院二零零八年五月摘要重组枯草芽孢杆菌生产核黄素是目前最先进的核黄素工业生产技术。构建高产核黄素的重组菌，关键问题之一是提高核黄素操纵子的表达水平。利用游离或整合的表达质粒过量表达核黄素操纵子，需要利用抗生素的选择压力维持游离质粒的稳定，或者维持整合质粒在染色体上的多拷贝状态。在重组枯草芽孢杆菌中，重组质粒不稳定问题是限制重组枯草芽孢杆菌工业应用的主要因素。实现单拷贝基因在染色体

2、上的高水平表达，构建无抗性基因标记的重组菌株，是解决重组质粒不稳定，避免抗性基因和抗生素危害的有效手段。本文利用丑subtilisglnR基因天然的组成型强表达启动子和含有SD序列的mRNA前导区编码序列，对最subtilis核黄素操纵子的启动子区域进行原位替换修饰，目的是去除原有的riboswicth调控元件，更换强启动子，在mRNA的57末端引入另一个SD序列，以实现核黄素操纵子的高水平表达。通过重叠PCR拼接了一段带有氯霉素抗性基因和核黄素操纵子上下游序列的A．CAT-R片段，转化过量合成核黄素的B．subtilis24X1，通过双交换重组，用氯霉素抗性基因将核黄素操纵子的启动子区域交换

3、下来，得到了抗氯霉素的核黄素缺陷型B．subtilis24CSl。通过重叠PCR拼接了一段包括glnR基因启动子区域和核黄素操纵子上下游序列的A-prm．R片段，转化B．subtilis24CSl，通过同源重组将氯霉素抗性基因交换下来，同时修饰了核黄素操纵子的启动予区域，得到了转化子B．subtilis24CS2。菌落呈现的黄色表明，修饰后的启动子区域能够使核黄素操纵子正确表达。关键词：r汤操纵子核黄素启动子表达枯草芽孢杆菌ABSTRACTGeneticreconstructedBacillussubtilishasbeenappliedsuccessfullyinriboflavinprod

4、uctionandisthemostadvancedmethod．Inordertoconstructriboflavin．producingstrain，thekeypointistoimprovingtheexpressionleveloftheriboperon．Traditionally,theriboperonismultipliedwithinintegrationplasmidormaintainedwithinthedissociativeplasmidbypuRingantibioticpressurefortheoverexpressionofriboperon．Thest

5、rategyindeedenhancetheexpressionlevelofriboflavin，however,itleadtoapotentialenvironmentalharmnessandproductionpollutionbecauseoftheantibioticpressurementionedabove．ThispaperusethenaturalconstitutedstrongoperonandmRNAleadingsequenceofgenggInRinB．subtilischromosometoreplacetheoriginalpromoterregionofr

6、／boperon，whichaccomplishthemodificationrightonthesiteofriboperon．AgenesequencewithantichloramphenicolA--cat-·RiscreatedbymultiplePCR．Byhomologousrecombinationtheriboperonpromoterregionofsourcebacterial，RecA+B．subtilis24X1wasreplacebyA-cat—RAnthisway，B．subtilis24CS1withantichloramphenicolandriboperon

7、mutationiscreated．AgenesequencewithpromoterandSDsequenceofgInRiscreated．BymultiplePC良recombinativeA'-prm-R’sequenceiscreated．ByhomologousrecombinationA，．prm—R’toB．subtil西24CS1，ther汤operonpromoterregio