蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体构建

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1、摘要蚯蚓纤溶酶(EFE)是一组存在于蚯蚓体内的丝氨酸蛋白水解酶，具有纤溶活性或纤溶酶原激活活性，既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成，可以口服，目前已广泛用于临床。本研究拟将EFE7#组分编码基因导入到番茄中，以期丌发含有预防和治疗血栓疾病的基因工程食物。本研究首先构建了EFE基因的表达载体pF，将EFE基因置于组成型启动子CaMV35S的启动之下，并添加表达调控元件；根据已经发表的番茄果实成熟过程中的果实特异性表达的E8基因的启动子序列设计了引物，克隆了“红宝石’’番茄品种的E8启动子，并构建了由E8启动子驱动EFE

2、基因表达的载体pEF。构建的表达载体pF和pEF经过酶切、PCR和测序鉴定，表明EFE基因已经成功重组到了表达载体上，载体的构建成功为EFE基因在番茄果实中表达奠定基础，具有一定的理论价值和实践意义。关键词l番茄；E8启动子：蚯蚓纤溶酶；植物基因工程河北大学理学硕士学位论文AbstractEarthwormFibrinolyticEnzymesbelongtoserineproteasefamily,foundinearthwormmidgut．Theycallelicitboththethrombuslysisan

3、dinhibitionofthrombusformation．DrugscontainingEFEhasbeenadoptedclinicallyfordecadesinChina．Inthisassay,weaimtointroduceEFEgeneintotomatogenome，hopingtodevelopGMOfoodthatCanserveasanewhealthyfoodforpreventingthrombusformation．Firstly,expressionvectorpFWasconstru

4、cted，inwhichEFEgeneWasplaceddownstreamoftheconstitutivepromoterCaMV35S．SecondlgaccordingtothepublishedpromotersequenceoftomatoE8gene，apairofprimersweredesignedandsynthesizedtoamplifyandcloneE8promoterfromthetomato‘'HongBaoshi”．Tomatofruitspecificexpressionvecto

5、rpEFWasconstructedbyreplacingthe35SpromoterinpFtodriveEFEexpressioninaspecificmanner．Finally,vectorspFandpEFwereanalyzedbyrestrictionenzymedigestion,PCRmethod，andsequencing．DatacolletedSOfarindicatedthatEFEgenewasrecombinedtotheexpressionvectors．Theseworklajd廿l

6、efoundationfortheultimateintroductionofEFEgeneintotomatogenome．Keywords：Tomato；E8promoter；Earthwormfibrinolyticenzymes；PlantgeneticengineeringⅡ河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的

7、学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：遂壹盘吼珥年』月坐同学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公稚论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于l、保密口，在年——月——日解密后适用本授权声明。2、不保密口。(请在以上相应方格内打“巾)作者签名：导师签名：吼埠年』月旦同日期：兰!]年

8、—白』丝R第1章文献综述1．1血栓疾病1．1．1血栓疾病的危害血栓疾病是一种严重影响中老年患者生命质量和威胁人类生命的常见临床疾病，其患病率和死亡率居首位：绝大多数情况下，血栓的形成可引起血管腔阻塞或血栓性疾病(thromboticdiseases)有损于机体，如下肢静脉血栓形成可引起十分严重的水肿，心脏及静脉内血栓脱落、冠状动脉血栓形成、大脑