蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究

《蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、维普资讯http://www.cqvip.com氪基酸和生物费担·34·AminoAcids＆BioticResources1999．21(4)：3d～38蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究‘一rc十6主：!(武．汉大．学生命科学学院武汉430072)r6摘要蚯蚓圩溶酶(EPA)抽提聩经3O～7O％饱和度的(NH_)2s0。盐析、DEAE一纤维索柱层析、SephadexG一75葡聚糖凝胶过滤等纯化步骤，得到了具有纤溶活性的洗脱峰，置凝致电泳后，得到四十活性组分，它们经5o'c保温6h，活力上升64；在2mol／L盐酸瓤存在时，活力

2、仅保存72．当其藏度降低时，活力可恢复至90I在1SDS存在时·括力仅保存12．1，但当SDS除去时，括力又可恢复。因此．盐酸肌、SDS均为EPA可逆性抑制剂另外一EPA中含有鞍高的糖链(占总量的45)，具有良好的抵抗自水解作用关键词蚯蚓纤溶酶括性染色稳定性蚯蚓纤溶酶(earthwormplasminogenacti站)；盐酸胍(上海试剂二厂)；TritonX一100vator，EPA)，又称作蚓激酶(Lumbrokinasc，(FlukaAG，BuchsSG)；十二烷基硫酸钠LK)。它是从蚯蚓体内提取的一种具有纤溶活(SD

3、S，日本进口)；其余试剂均为国产分析纯产性的蛋白水解酶。它广泛分布于蚯蚓的消化道品。电泳仪(武汉大学科教仪器厂)；电泳槽内腔中。能直接降解血中纤维蛋白原及激活纤(PAGE一2001，上海华泳工贸有限公司)；752C溶酶原为纤溶酶，刺激血管内皮细胞释放t—型紫外可见分光光度仪(上海第三分析议器PA。自1983年日本官崎医科大学Mihara等厂)；HD一88—5AⅡ型核酸蛋白检测仪(浙江华阳从粉正蚓(Lumbricusrubeltus)中分离出蚯蚓纤生物仪器厂)溶酶以来‘，已引起中国、韩国、日本等众多学1．2方法者的关注。近几年

4、的临床应用表明，蚓激酶胶囊1．2．1纯化将活的赤子爱胜蚓洗净，放人清是一种具有直接和间接两种纤溶活性的溶挂类水中吐沙(约3h)，然后用蒸馏水漂洗干净，再药物，疗效良好，服用方便，且较安全。。本加五倍体积30mmol／INa一20mmol／I磷文以赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)为材料，对影酸钠缓冲液(pH7．2)匀浆，4℃抽提(约3h)后响酶活力的因子等问题进行了较深入的研究，离心(9，000r／rain．30rain)。取上持液，进行所获得的试验资料对进一步认识和开发蚓激酶30～70饱和度(NH)S0分级盐析。得

5、到具有重要意义。的沉淀用30mmol／LNaC1—2Ommo[／L磷酸铺缓冲渡(pH7．2)溶解，充分透析后，经1材料和方法DEAE-纤维素柱层析和SephadexG一75葡聚1．1材料和试剂蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eiseni—糖凝胶过滤进行纯化。nfoetida)，属正蚓科，爱胜蚓属，由华中农业大I．2．2酶活性测定参照文献E6]进行：将学朱国树老师赠送；苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐BAEE溶于0．1mol／ITr一HCl缓冲液(pH(BAEE)(上海生化所东风生化技术公司)；酪8．O)，配制成0．2rag／m!浓度的溶液，取1．4

6、蛋白(中国医药公司上海化学试剂采购供应ml置石英杯中，加人100ulEPA液，立即计·啦稿B期：1999一O7—05维普资讯http://www.cqvip.com章骥等蚯蚓纤藩酶的纯化及稳定性研究·35-时，在253mm测定0．5～2min消光值的变1．2．4．3SDS和TritonX一100将200ut化。EPA分别配制含0．01、0．05、0．1、0．1．2．3活性染色SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳5、1的SDS溶液I．5ml，或配制含I(SDS—PAGE)参照文献[7]进行，分离胶浓度为TritonX一1O0以及含0．1

7、SDS和1Tri—l0，浓缩胶浓度为3．7活性染色参照文献tortX一1O0的纤溶酶溶液各1．5ml，37C水浴[8]进行，醅蛋白为酶的催化底物。凝胶配制保温30min，取1．4mt，加入1O0ulBAEE．见表1。同上方法测定其水解活力。在制备凝胶之前，首先将2g酪蛋白用2O1_2．4．4糖链的水解取lmlEPA，加入ml0．1mol／INaOH加热溶解后，用lmol／L100ul1O0U／ml1，3半乳糖苷酶，置37CHC1调回至pH9．0左右，再加蒸馏水定容至水浴保温2h。测定酶在30min和l20min时100ml，

8、制成2酪蛋白溶液。酶溶液与1O水解活力SDS和含0．25溴酚兰的40蔗糖比例为2：1：1(V／v／v)混匀后，每孔上样量1Ol。2结果和讨论电泳在低温(4℃)下进行(20mA恒流)。当溴2．1EPA的纯化EPA抽提液经3O～酚兰移至距底部约1cm时，关闭电源将胶取70饱和度(NH)2so．