根霉纤溶酶液态发酵、分离纯化和酶学性质研究

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1、摘要血栓性疾病严重威胁人类生命和健康，近年发病率有增加趋势。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的手段。目前临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类，尽管这些药物的疗效岢定，但还存在许多缺陷，而且价格昂贵。因此研制高效、快速、价廉的新型溶栓药物的需求迫切。本论文对根霉RhizopuschinensisYY-15液体摇瓶发酵产生纤溶酶的：[艺条件进行了优化，建立了该菌株发酵产生纤溶酶的制备分离纯化方法，研究了该菌株产生纤溶酶的部分酶学性质。优化了根霉RhizopuschinensisYY-15菌株产纤溶酶液体摇瓶发酵条件。首先对发酵培养基进行了优化，运用单因素实验法研究了不同碳源、

2、不同氮源、不同碳氮比例、不同培养基初始pH对菌株发酵产生纤溶酶的影响，确立了培养基各组成成份的适宜水平。进一步采用正交实验对菌株发酵产生纤溶酶的发酵时间和接种量进行了优化。结果表明，麸皮和豆粕是该菌株液体发酵产生纤溶酶的适合碳源和氮源。实验范围内的最适培养基组成是：麸皮浓度3％(w／v)，豆粕浓度5％(w／v)，培养基初始pH5．0。适宜接种量6％，培养时间72h。根霉RhizopuschinensisYY’15在优化条件下液体摇瓶发酵平均产酶量为98．31U／ml(尿激酶单位)。对根霉RhizopuschinensisYY-15产生纤溶酶的制备分离纯化工艺进行了探索和研究

3、，建立了酶的分离提纯：I：艺。根霉液体发酵液中的纤溶酶用40％--70％饱和度硫酸铵分步盐析、PhenylSepharoseFastFlow疏水相互作_L}j色谱、DEAE．SepharoseFF离子交换色谱和SephacrylS一100凝胶过滤色谱顺序分离后，可得到经高分离度的疏水相互作用色谱ResourcePhe证明为均一的纤溶活性组分。用上述流程将纤溶酶提纯了90．5倍，活力回收46．5。对用上述流程提纯的纤溶酶的部分性质进行了研究。凝胶层析方法测定根霉纤溶酶分子量为20．3kDa。等电聚焦方法测定该酶等电点82。纤溶酶比活力2416．86U／mg。纤溶酶最适作用温度

4、50℃，37。C保温4h酶活力保持88％，43℃和50。C保温4h酶活力保持57％}132％，60。C保温1h酶活力保持53％。纤溶酶最适作用pH为88，最稳定的pH范围是6．8—8．8，在该pH范围内，37。C保温24h，酶活力保存80％以上。酶的pH稳定性很好。酶与氨基酸侧链修饰试剂在37。C保温30min后，EDTA、PMSF和Aprotinine对纤溶酶有抑制作用，而且随着抑制剂浓度的增大，其抑制作用也增加：而抑制剂PCMB、Lys和TPCK对该纤溶酶无明显的抑制作用。初步可以判定金属和丝氨酸位于或临近该纤溶酶的活性中心。根据已确定的该纤溶酶的酶学性质可以肯定，根霉

5、RhizopuschinensisYY_15液态发酵产生的纤溶酶是一种新的纤溶酶。该酶的优点是分子量相对较小，比活力较高，温度和pH稳定性好。该酶具有潜在的应用前景。本文的研究：l二作为该酶的进一步酶学性质和医学实验研究奠定了基础。关键词：发酵：分离提纯；纤溶酶；酶学性质：优化Fermentation，PurificationandPartialCharacteristicsofaNovelFibrinolyticEnzymeofRhizopusChinens&YY．15AbstractThrombosisintimidatesmankind’slifeandhealths

6、eriously；themorbidityofithasincreased．Fibrinolytictherapyisavailable．Currentfibrinolytiuenzymesavailableforclinicalusearemostlyplasminogenactivators．Despitetheirwidespreaduse，alltheseagentshaveundesiredsideeffectsandareveryexpensive．Thereforethesearchesfornewfibrinolyticenzymesfromvariouss

7、ourcesarebeingcontinued．ThedissertationfocasedonoptimizationofliquidfermentationconditionofRhizopuschinensisYY-15forproductionafibrinolyticenzyme，purificationofthefibrinolyticenzyme，andpartialcharacteristicsoftheenzyme．TheliquidfermentationconditionofRhizopusc