豆豉纤溶酶的分离纯化、酶学性质的研究与微胶囊的制备

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1、摘要豆豉纤溶酶(E。C。3。4．21．7)是一种从中国传统食品豆豉中分离出来的具体较高纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。它不仅能直接溶解纤维蛋白，抑制血栓形成，并且能够抑制机体凝血，抗血小板聚集等功能。本论文对DC．10产纤溶酶的分离纯化、酶学性质、微胶囊的制备及性质进行了系统的研究。(1)采用TAME法作为豆豉纤溶酶的测定方法，操作简单、快速；精密度较高，重现性高。(2)对DC．10菌株产纤溶酶的分离纯化进行了研究。利用硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadcxG．75凝胶过滤层析等方法进行纯化，获得

2、了纤溶酶单一组分，表观分子量为30kDa，最终纯化倍数达lO．17，回收率为16．69％。(3)对DC．10产纤溶酶的部分酶学性质进行了研究并利用N．末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF．MS)对此酶进行鉴定。该纤溶酶在50。C以下和pH7．0-9．0之间保持稳定，最适温度为35℃；最适PH为8．6；N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。(4)通过挤压法豆豉纤溶酶微胶囊，以海藻酸钠一氯化钙一壳聚糖体系制备出微胶囊。检测结果表明，微胶囊酶活可达到162．9

3、6IU／mL，包埋率为90．25％。经胃酸、胆汁酸处理后酶活114．07IU／mL以上，对酸有很高的耐受力；经人工肠液处理35min，微胶囊几乎全部崩解，肠溶释放率可达到97．42％。本课题对新型溶栓药物—一豆豉纤溶酶的分离纯化、酶学性质、微胶囊的制备进行了系统研究，目前还没有见到关于豆豉纤溶酶微胶囊的报道。本课题的研究结果为豆豉纤溶酶发酵产品的大规模纯化和迸一步研制开发新的溶栓药物剂型提供重要理论依据。关键词纤溶酶；豆豉：分离纯化；性质；微胶囊东北林qk大学硕上．学位论文AbstractDochiFibrinolyticEnzyme正．

4、C．3．4．21．7)isakindofserineproteaseandactsas觚importamfibrinolyticandantithromboticenzyme．Doc“FibrinolyticEnzymeWaSpurifiedandthecharacteristicsofDochiFibrinolyticEnzymeweremeaSured．AnovelmethedWaSdevelopedforthepreparationofmirocapsuleoftheFibrinolyticEnzyme．(1)TheTAMEmeth

5、odWaSappliedtodeterminatetheactivityofFibrinolytieEnzyme，whichprovidedarapidmeansofdetection．(2)Fibrinolyticenzymewaspurifiedbyammoniumsulfatefractionalprecipitation,anion-exchangechromatographyandgelfiltration．Asingleproteinfl删onwithfibrinolyticactivityWaSobtainedfromthe

6、liquidmedium．．nlerelativemolecularweightofpurifiedproteinis30kDa，ThepurificationfoldWaS10．17andrecoveryoftotallaccaseactivityw舔16．6钟么(3)Thepurifiedfibrinolyticenzymewasstableblow50℃andmaintaineditsactivityatpH7．0"-9．0．TheoptimaltemperatureandpHwere35℃and9．0，respectively．W

7、esearchedtheDatabasefortheressultofMALDI-TOF—MS．Homologiesofupto100％werefoundwiththefibrinolyticenzymeandnattokinase．(4)Weresearchtheextrusionmethodofmieroeapsulesthatalginatesodium,calciumCm嘶deandchitosanwereusedfortheprincipalwallmaterialinproduction．Theresultshowedthea

8、rnotmtofactiveweremorethan162．96IU／mLandtheembedratiocouldteach90．25％．Whenmicrocapsulesweredispo