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《07豆豉纤溶酶高产菌株的筛选研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第37卷第1期工业微生物Vol.37No.12007年2月IndustrialMicrobiologyFeb.2007豆豉纤溶酶高产菌株的筛选研究3张自强,张云开,陈桂光,梁智群(广西大学生命科学与技术学院食品发酵工程研究所,南宁530004)摘要以中国豆豉为材料,取6个不同来源的样品经富集培养后,用自制血纤维蛋白平板进行初筛;利用LB纤维蛋白平板复筛与血琼脂平板进行体外溶血试验相结合的方法,筛选出安全性良好并有一定纤溶活性的菌株。再对复筛得到的菌株进行摇瓶培养,用纤维蛋白平板法测定并比较不同菌
2、株发酵液的纤溶活性。结果成功地筛选出5株纤溶活性高和通过溶血性实验的芽孢杆菌菌株,其中菌株DC2C4粗酶液的酶活稍高,达到280IU/mL。采用16S223SrDNA序列分析法及传统的生理生化特征鉴定法对该菌株进行鉴定,确定菌株DC2C4为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。本实验为开发新型溶栓药物及保健食品提供了实验参考依据。关键词:纤溶酶;豆豉;筛选;纤维蛋白平板;16S223SrDNA1987年日本学者须见洋行(Sumi)首次对纳豆121℃,15min灭菌备用。将冷藏的粗制血纤维
3、蛋白[1]及其提取物作了系统研究,发现纳豆激酶(Nat2添加1倍体积蒸馏水打碎,置于微波炉内用中等火tokinase)有明显溶栓作用,是一种非常有前途的溶力加热使其凝结,再用食品加工机打碎,121℃,[2]血栓、抗血栓的新型药物。中国传统食品豆豉与15min灭菌备用。在超净台中将纤维蛋白悬浮液加纳豆类似,在发酵过程中亦可能产生具纤溶活性的入营养培养基中,制得富集培养基。[3]激酶。近年的研究发现豆豉中具有多种生物活初筛培养基(%):自制血纤维蛋白2,蛋白胨性物质,其中豆豉激酶被证明除了具有前两代
4、溶栓1,NaCl0.5,琼脂2,调pH7.2。[8]药物的优点之外,还具有无毒副作用、不引起内出复筛培养基:LB培养基,pH7.0～7.2,灭菌血、半衰期长等特点。因此,豆豉很有希望开发成为备用。将100mLLB培养基融化后置于45℃水浴新的保健(功能)食品。本研究致力于从几种不同产锅中(A);在25mL磷酸缓冲液(PBS,0.01mol/L,地的市售豆豉中筛选高纤溶酶活力的出发菌株,为pH7.8,以下均同)中溶解55mg血纤维蛋白原后置开发新型溶栓药物及保健食品提供实验参考依据。于45℃水浴(
5、B);取5mLPBS溶解50U凝血酶置于45℃水浴(C)。将C加入A中,再将B加入,迅速混1材料匀后铺平板,静置冷却。[4]材料与试剂:6种不同产地的豆豉购于市场(豆血琼脂平板:调pH8.0,灭菌后于45℃时加##豉样品1～6分别产自四川、云南、山东、广西、浙入新鲜猪血(5%～10%),混合均匀倒平板。[5]江和福建)。大豆胰蛋白胨来自北京双旋微生物培斜面培养基:调pH至7.2。[5]养基制品厂。酵母抽提物为Sigma公司产品。冻干种子培养基:调pH至7.2。[5]人纤维蛋白原购自上海莱士血制品
6、有限公司。尿激发酵培养基:调pH至7.2。酶购自哈尔滨三联药业有限公司。凝血酶购自广西2方法华兴生物制品有限公司。Taq酶为TaKaRa(大连)公司产品。其他试剂均为国产分析纯。2.1富集培养富集培养基(%):蛋白胨1,NaCl0.5,pH7.2,(1)血纤维蛋白的提取。作者简介:张自强(1979～),男,硕士研究生。3通讯联系人,电话:0771-3270733,E-mail:zqliang@gxu.edu.cn—67—第1期工业微生物第37卷取1.5L新鲜猪血,4℃冷藏1～3h产生凝血较,查出
7、样品酶活。块。将凝血块放入食品加工机,加入1倍体积的去尿激酶标准曲线的绘制:取适量尿激酶标准品,离子水,打碎后8000r/min、10min离心,去上清液,用PBS制成2IU/μL,4IU/μL,6IU/μL,8IU/μL,用去离子水洗涤沉淀,反复打碎、离心、取沉淀、洗10IU/μL标准液。分别取10μL标准酶液,加入纤涤,直至沉淀无红色为止,即得到粗制的血纤维蛋维蛋白平板上的孔中。37℃培养18h后测量透明圈白。置于4℃冷藏。的最大直径以及与之垂直的直径,计算直径乘积;以(2)接种。直径积为横
8、坐标,酶活为纵坐标,在对数坐标纸上制##从市售的豆豉样品1～6中分别取几粒放入作标准曲线。无菌研钵中,加3mL无菌生理盐水,磨碎后静置,用2.6菌种鉴定微量移液器取上清液1mL,加到富集培养基中,2.6.1基因组DNA的提取37℃,150r/min培养72h。取出,在超净台中用无菌菌株接入发酵培养基,培养至对数生长期后期,[8]生理盐水进行梯度稀释。8000r/min,5min,离心收集菌体,参照文献提取基2.2菌种的初筛因组DNA。富集培养液梯度稀释后涂布于初筛培养基平板2.6.216S223
