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《蛇毒纤溶酶ALF基因在大肠杆菌中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第34卷第12期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.34No.122006年12月Jour.ofNorthwestSci2TechUniv.ofAgri.andFor.(Nat.Sci.Ed.)Dec.2006X蛇毒纤溶酶ALF基因在大肠杆菌中的表达张守涛,史婧,李楠,郭蔼光(西北农林科技大学农业分子生物学陕西省重点实验室,陕西杨凌712100)[摘要]根据蛇毒纤溶酶(Alfimeprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其
2、分别连接在融合标签NusA,Thioredox2in,Skp,HisTag和信号肽pelB的C端,构建成了多种ALF表达载体p432Alf,p252Alf,p322Alf,p152Alf和pSkp2Alf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD2PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp2Alf表达量最高,目的蛋白含量高达菌体总蛋白的45%。[关键词]蛇毒纤溶酶;循环延伸PCR;基因表达;Skp[中图分类号]Q786[文献标识码]A
3、[文章编号]167129387(2006)1220021204周围动脉硬化闭塞病(peripheralArterialoc2在成功克隆ALF全基因序列的基础上,将其分别融clusive,PAO)是指周围动脉粥样硬化导致动脉狭窄合在不同的融合Tag或信号肽后构建了多个表达载甚至闭塞,从而使远端组织出现相应缺血痉挛或坏体,并对其进行转化筛选和诱导表达,研究了在不同[1]死。国外老年人PAO的患病率为12.4%～25%,元件或Tag下ALF在大肠杆菌中的表达情况,现将在老年高危人群中PAO患病率更高。PAO和其他研究结果报道如下。
4、一些与年龄有关的心脑血管疾病一样危险,是全身1材料与方法血管系统动脉粥样硬化的一个标志。随着社会老龄化程度的增加,此病的发病率呈上升趋势。1.1材料Fibrolase是来自美国铜头蝮蛇毒的一种锌金1.1.1菌株、质粒及主要试剂大肠杆菌菌株[223]属蛋白酶,具有纤溶活性而无出血活性。Fibro2XL12blue,OrigamiB(DE3)及表达载体pET43.1a,lase的溶栓机制与现在临床上应用的溶剂t2PA和pET25b(+),pET32a和pET15b(+)均由西北农林链激酶等不同,其直接作用于血栓,专一裂解纤维蛋科
5、技大学农业分子生物学陕西省重点实验室保存;[4]白(原)AA2链的lys4132leu414键。在动物试验中,pBS2T载体、PfuDNA聚合酶、质粒提取和胶回收Fibrolase能快速持久地溶栓而不引起生理学改变,试剂盒均购自天为时代公司;限制性内切酶和T4[5]且副反应很少。DNA连接酶为Promega公司产品。蛇毒纤溶酶(AlfimepraseALF)蛋白是Fibro21.1.2引物根据SKP基因序列(GenBanklase的N端突变体(前3个蛋白的氨基酸EQR由SerNo.M21118)设计1对引物,用于SKP基因序
6、列的取代),与Fibrolase具有同样的溶栓功能,现已开始合成。正向引物:5′2cgctcatatgaaaaagtggttatt用于PAO治疗的Ë期临床试验。ALF蛋白的Ê期agctgcag23′;反向引物:5′2cgcgaattcggatccatt临床试验结果显示,ALF蛋白能快速地使病人动脉atttaacctgtttcagtacgtc23′(正向和反向引物中下血再灌注,再通率高且再灌注时间短,可以与其他溶划线分别表示NdeÉ和EcoRÉ酶切位点,黑体分别[6]栓药物配合使用。这些都显示ALF蛋白很有希望表示起始密码子和
7、终止密码子)。引物由上海生工生成为第一个蛇毒基因工程溶栓药物。物工程有限公司合成。[3]Loayza等在酵母中表达了rFibrolase,但迄今1.2ALF基因的合成为止尚未见在大肠杆菌中表达ALF的报道。本实验根据ALF蛋白的氨基酸序列(GenBankNo.X[收稿日期]2005212209[作者简介]张守涛(1972-),男,河南开封人,在读博士,主要从事生物技术药物研究。[通讯作者]郭蔼光(1943-),女,陕西西安人,教授,博士生导师,主要从事分子生物学研究。E2mail:gaguang@nwsuaf.edu.cn©
8、1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net22西北农林科技大学学报(自然科学版)第34卷P28891,图1)及大肠杆菌密码子的偏爱性,设计并物为模板
