血管生成抑制因子arresten的真核表达体系的

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1、血管生成抑制因子arresten的真核表达体系的【摘要】目的构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2arresten将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得阳性细胞克隆，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测arrestenmRNA表达，免疫蛋白印迹技术(EM无血清培养基的CHO细胞中，6h后将培养液换为含血清的F12培养基培养。1.2.2阳性克隆的筛选转染后的第24h，将培养板中的细胞按1∶10比例分散培养，转染后的第48h开始加抗生素Zeocin进行筛选，筛选浓

2、度为130μg/ml，出现阳性克隆后，100μg/ml维持筛选约15d。1.2.3逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测转染的arresten基因的mRNA表达根据已知的arresten基因序列，使用Primer5引物设计软件设计引物,引物由上海生工工程有限公司成。上游引物序列P1为：GTCAGGATCCTCTGTTGATCACGGCTTC，下游引物序列P2为GGGCAAGCTTTGTTCTTCTCATACAGAC；内参照物βactin上游引物序列βactin1为CTCCGCAGGGTGTGATGGTG；下游引物序列βactin2为AGAAGGGCGTGC

3、TGAGAAGTTGA。arresten、Bactin的扩增片断分别为711bp和307bp。采用一步法行RTPCR，反应体系：RnaseFreeH2O19μl,5χReactionBuffer10μl,2.5mMdNTPs6μl,25mMMn(Oac)2μl,P12μl,P22μl,βactin12μl,βactin22μl,10u/μlRnase抑制剂2μl,2.5u/μlrTthDNApolymerase2μl,总RNA2μl。反应条件：60℃,30min；94℃,2min；94℃,10min，60℃,1.5min,共40次循环；最后，60℃延伸7

4、min。产物行2%琼脂糖凝胶电泳。1.2.4免疫印迹技术（：marker；1:转染pSecTag2arresten组;2:转染pSecTag2组;3:未转染的空白对照组图1转染基因的RTPCR鉴定2.3真核arresten蛋白的表达an提出了“肿瘤的生长必须依赖血管”的著名论点，并逐渐被人们所接受。从那时起，抑制血管生成是抗肿瘤治疗研究的热点。近年来，国内外医学专家研究发现，肿瘤血管是肿瘤细胞生长和转移的形态学基础，肿瘤血管除向肿瘤细胞提供营养外，还不断地向人体其他部位输送肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的生长和转移。因此，抑制血管生成是有效的抑制肿瘤细胞生长也转移的的手

5、段。目前，血管生成抑制剂的研究主要有如下4种策略：(1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力；(2)直接抑制内皮细胞的功能；(3)阻断血管生成因子的合成和释放，拮抗其作用；(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用[2]。arresten是Colorado等在2000年发现的血管生成抑制因子，该因子能够抑制裸鼠移植瘤的生长。arresten与内皮抑素同为来自胶原蛋白的血管生成抑制因子，但与内皮抑素endostatin一样无任何毒副作用，而且它还有arresten自身的优点，它是一种稳定的蛋白质，能够有效的保持其活性，而内皮抑素因其蛋白质的不稳定可能限制其使用，更重要的是，arre

6、sten抑制裸鼠移植瘤生长的效果均强于内皮抑素[1]。然而arresten确切的抑制血管生成的具体途径及其相关机制目前并不清楚，而获得该因子是深入进行arresten相关研究的前提。我们在先前研究已经在国内首先获得原核表达的arresten蛋白[3]，原核表达虽产量高，但产物的复性差、活性低，我们用原核表达的arresten进行的相关实验也未得到理想的结果。而CHO细胞是目前较常用的真核表达体系，它可较长时间地表达所携带的基因而不衰减,并能稳定地大量表达，其表达产生的蛋白质具有糖基化、磷酸化等修饰，具有良好的生物学活性，因此被广泛用于蛋白表达和疫苗生产。我们通过脂质

7、体转染方法行将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得了阳性克隆细胞，随后进行的RTPCR证实我们成功在CHO细胞中导入arresten基因，并通过phausG,etal.antiangiogeniccuesfromvascularbasementmembranecollagen[J].CancerRes,2000,60（11）:25202526.［2］HanahanD,FolkmanJ.Patternsandemergingmechanismsoftheangiogenicsorigenesis[J].Cell，1996,